可高产蛋白酶的芽孢杆菌及其用途制造技术

本发明专利技术涉及的可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ，于２００４年６月２８日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１１８０。其为以保藏号ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ１．７６９的枯草芽孢杆菌ＣＡＵ２０８作为出发菌株，将其单细胞悬浮液依次并循环进行“变紫外线诱变→亚硝基胍诱变→紫外线与亚硝基胍复合诱变”，最后得到一株可高产蛋白酶的芽孢杆菌；可用于液体发酵制备大豆生物活性肽饲料添加剂、酶制剂、富酶益生素等。所制备的肽类饲料添加剂具有多种用途：提高禽蛋品质；满足消化系统尚未成熟动物的营养需要；补充患过敏性疾病动物的蛋白需要或用来作为乳猪、仔猪等幼龄动物的优质蛋白源，防止豆粕（饼）等蛋白饲料对其产生的肠道粘膜过敏和水肿等疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说是涉及一种可高产蛋白酶的芽孢杆菌及其诱变选育方法和用途。
技术介绍
许多年来在动物饲养和饲料中广泛使用抗生素、化学合成药物、激素等促生长保健剂，导致了畜禽和水产产品中药物残留严重、畜禽产品品质下降、细菌耐药性增强、耐药菌株增多，给人类安全和生态环境带来很大威胁。由于抗生素的诸多副作用，特别是近年来消费者对食品安全问题的关注，世界各国都在纷纷禁用或限制抗生素的使用，并加速开发、推广新型安全高效的绿色饲料添加剂，以减少或替代抗生素等药物添加剂。微生态制剂和大豆生物活性肽因其独特的理化特性和生物学功能而成为新型绿色饲料添加剂领域的研究热点。目前国内市场上可见到大豆肽，多为进口产品，价格昂贵，主要是通过酶法来生产的。酶法是应用蛋白酶如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶或用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，将大豆蛋白降解为小肽，但这种方法生产的大豆肽容易产生令人难以接受的腥味或苦味，且生产成本高，不适于在畜牧业中应用；微生物发酵法与酶法相比可将微生物产酶和酶解合二为一，缩短工序，降低成本，且大豆肽产品有天然的芳香味，口感好。在工业微生物发酵生产的过程中，决定生产水平和生产成本高低的最主要因素有三个生产菌种、发酵工艺和后提取工艺或后加工工艺，其中，最重要的是生产菌种的特性。从自然界分离出的菌种，由于生产能力低，往往不能满足工业上的需要。因为在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。但是，发酵工业的需要与此相反，需要微生物能够积累大量的代谢产物，如酶或其它活性成分等。为此，采用种种方法来打破菌种的正常代谢，使之失去自我保守性的调节控制，从而大量积累我们所需要的目标代谢产物(如蛋白酶)。要达至此目的，主要措施就是进行菌种选育，如进行物理和化学诱变等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术制备活性肽饲料添加剂的成本高而不易于在动物养殖行业推广使用的缺陷，通过物理和化学的复合诱变选育一株可高产蛋白酶的芽孢杆菌，使其能经发酵生产出在饲料中的添加量低、功能明确，并具有提高动物对营养素(如蛋白质、矿物质、维生素等)吸收利用率、提高奶、肉、蛋产量和生产能力，且改善奶、肉、蛋的品质和风味，刺激动物免疫器官发育，提高抗病力和减少发病率，并能明显改善水产动物养殖水质，提高水产动物生长速度和存活率，能广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，可作为抗生素的替代品等优点的活性肽饲料添加剂。本专利技术的另一目的在于提供一种可高产蛋白酶的芽孢杆菌的诱变选育方法。本专利技术的再一目的在于该可高产蛋白酶的芽孢杆菌用于液体发酵制备大豆生物活性肽饲料添加剂或酶制剂、富酶益生素等的应用。本专利技术的技术方案如下本专利技术提供的可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其特征在于，该可高产蛋白酶的芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp，于2004年6月28日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1180。细胞呈直杆状，电子显微镜测量为0.5-0.6×1.1-3.5μm，常以成对或链状排列；大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性；鞭毛侧生，能运动。芽孢呈椭圆形、柱状、圆形或卵圆，中生或偏生，0.8×1.5-1.8μm，能抗许多不良环境游，离孢子表面着色弱。洋菜培养基上的菌落圆形，表面色暗，可以起皱，可以变成奶油色或褐色；菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化；当洋菜培养基表面潮湿时，菌落易于扩散；在洋菜上生长的菌苔在液体中不易扩散，在培养液中色暗、皱褶、完整的膜、清度混浊或不混浊。好氧或兼性厌氧，具有对热、pH和盐各种多样性的生理特性。化能异养菌，具有发酵或呼吸代谢类型，通常接触酶阳性。生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。本专利技术提供的可高产蛋白酶的芽孢杆菌的诱变选育方法，其诱变选育步骤如下1)以选购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCCNo 1.769的枯草芽孢杆菌CAU208作为出发菌株；2)诱变选育(1)制备出发菌株CAU208单细胞悬浮液将出发菌株芽孢杆菌CAU208接种于灭菌后的液体培养基A中，28～32℃摇瓶培养36～48h，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于无菌的装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞悬液，用无菌玻璃棉过滤，得到出发菌株CAU208单细胞菌悬液；所述的液体培养基A所含组分及配比为蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，水1000ml；(2)紫外线诱变调节步骤(1)所得出发菌株CAU208菌悬液的活菌数为106～108个/ml之间，液层厚度0.2～0.4cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率15～18W，照射时间2～5min，照射距离25～30cm；照射后立即稀释涂布在初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用茚三酮法显色法测定水解度，选择2～4株水解能力最高的菌株，再分别作摇瓶发酵复筛，选出一株水解能力最高且稳定性好的菌株CAU208-N，并制成菌悬液用于下一步亚硝基胍诱变；所述的初筛分离培养基B所含组分及配比为蛋白胨1～3g，酵母浸粉2～4g，葡萄糖4～6g，脱脂奶粉5～8g，琼脂10～13g，水1000ml；所述的摇瓶发酵复筛的步骤是制备发酵液将氮源、碳源和水按重量份配比均匀混合后，在0.1～0.15mpa压力下，120～122℃灭菌，再冷却至30～37℃，制成发酵液；其中，氮源与碳源的重量份之和与水的重量份的配比为3～6∶100，氮源与碳源重量份配比为2～4∶1；所述氮源为豆粕粉、大豆分离蛋白粉等；所述碳源为玉米面或玉米面和糖蜜等；将得到的50～70个单菌落种子液接种于容量为250ml装有100ml发酵液的三角瓶中，种子液和发酵液按体积比0.5～1.0∶10的比例均匀混合，以110～140rpm的速度在摇床上进行发酵；发酵温度为30℃～35℃，发酵结束时用茚三酮法显色法测定水解度；(3)亚硝基胍诱变将步骤(2)所得CAU208-N菌悬液的活菌数调至105～108个/ml，菌悬液中加入终浓度为800～1000ug/ml的亚硝基胍，30～35℃水浴处理20～30min，间歇震荡；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N1，并制成菌悬液用于下一步紫外线与亚硝基胍复合诱变；所述摇瓶发酵复筛的方法同步骤(2)；(4)紫外线与亚硝基胍复合诱变将步骤(3)所得CAU208-N1菌悬液的活菌数调至107～109个/m1，菌悬液中加入终浓度为900～1300ug/ml的亚硝基胍液，30～35℃水浴处理20～30min，间歇震荡，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.2～0.4cm；进行紫外线诱变，所用紫外灯功率15～18W，照射时间6～9min，距离25～30cm；紫外照射诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N5；所述的摇瓶发酵复筛方法同步骤(2)；(5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其特征在于，该可高产蛋白酶的芽孢杆菌的分类命名为：芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ，于２００４年６月２８日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．１１８０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张日俊，于长青，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]