来自苛求芽孢杆菌的两种尿酸酶和其突变体及它们的聚乙二醇修饰与应用制造技术

来自苛求芽孢杆菌的两种尿酸酶和其突变体及它们的聚乙二醇修饰与应用；具体涉及来自苛求芽孢杆菌胞内和胞外的两种天然尿酸酶的同四聚体及它们各自的氨基酸序列，及这两种尿酸酶的Ｎ端前七个氨基酸缺失或被替换的突变体、Ｃ端缺失不多于十四个氨基酸残基的突变体和同时出现上述两类变化的突变体；这两种天然尿酸酶都抗黄嘌呤且对尿酸亲和力较低，在离子强度低时会解聚而失去活性；这些天然尿酸酶和其突变体都可在Ｎ端或Ｃ端带组氨酸纯化标签后用大肠杆菌进行重组表达，都可用于测定血清尿酸含量，都可用平均分子量不低于２０００的聚乙二醇单甲醚修饰后保留大部分比活性，从而可用于哺乳动物体内降低血浆尿酸水平治疗高尿酸血症相关疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及苛求芽孢杆菌胞内和胞外两种可溶天然单纯蛋白质同四聚体尿酸酶， 及这两种天然尿酸酶的突变体和它们的聚乙二醇单甲醚修饰产物，这些尿酸酶和其聚乙二 醇单甲醚修饰产物在临床检验测定血清尿酸含量和降低哺乳动物体内的血浆尿酸水平中 的应用。专利技术的
技术介绍
尿酸酶可特异性氧化尿酸，并生成尿囊素和过氧化氢。人体缺乏尿酸酶，尿酸是体 内嘌呤碱代谢终产物，主要经肾脏排泄。血浆中尿酸浓度过高称为高尿酸血症。尿酸在血 浆中的溶解度低，浓度过高会在血管壁沉积，诱发组织器官损伤和引起痛风等疾病，严重时 造成肾衰，危及生命。故血清尿酸水平是诊断痛风和肾脏功能的常规指标，而尿酸酶是实验 诊断领域测定血清尿酸含量的关键工具酶。尿酸的前体黄嘌呤是尿酸酶的强效竞争性抑制 剂，而血浆高尿酸通常伴随血浆高黄嘌呤。因此，需要抗黄嘌呤且催化效率高的尿酸酶。在白血病、淋巴瘤等血液肿瘤化疗时肿瘤细胞大量死亡裂解，胞内核酸大量降 解造成血浆尿酸急剧升高，形成以高尿酸血症为代表的肿瘤溶解综合症(tumor lysis syndromeJLS)，容易造成患者肾衰而死亡。所以，在肿瘤化疗过程中，需快预防和速降低血 浆尿酸应对TLS。另外，降尿酸也是治疗痛风的关键策略；别嘌呤醇等药物都有明显肝肾毒 性易引起过敏反应，在初始尿酸浓度很高时无效且对某些难治性痛风无效。尿囊素的优良 水溶性和肾脏对尿囊素的高效排泄使尿酸酶成为治疗高尿酸血症相关疾病的候选药物。临 床研究表明尿酸酶可快速高效降低血清尿酸，且几乎没有毒副作用；在应对肿瘤裂解综合 症时尿酸酶比别嘌呤醇更安全有效；尿酸酶可用于治疗痛风，给予一次尿酸酶后严重痛风 患者血浆尿酸水平可长时间维持正常。因此，抗黄嘌呤、催化效力高的尿酸酶也是治疗高尿 酸血症相关疾病的理想药物。已报道苛求芽孢杆菌可产生胞内和分泌到胞外的两种尿酸酶，但至今未明确此两 种尿酸酶的编码基因和对应的氨基酸序列。实验数据已证实苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶和胞 内尿酸的催化能力都很高，且抗黄嘌呤，在治疗高尿酸血症和血清尿酸测定两方面都可有 重要应用。苛求芽孢杆菌的天然胞内和胞外尿酸酶都可直接用于尿酸含量测定。外源尿酸 酶用于治疗高尿酸血症相关疾病时都需将其注射到血液中才能发挥作用。异源蛋白在人体 内半衰期短且易诱发机体免疫反应。用聚乙二醇单甲醚修饰蛋白是延长其体内半衰期、降 低其免疫原性的有效方法。常用的聚乙二醇单甲醚修饰试剂与蛋白质表面氨基或巯基反 应。对来自苛求芽孢杆菌的胞内和胞外尿酸酶及其突变体也可用活化聚乙二醇单甲醚修饰 其表面的氨基或巯基，从而延长其体内半衰期并降低此外源蛋白的免疫原性，保障用药的 安全性。所以，本专利技术涉及来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶及其对应突变体和聚乙二 醇单甲醚修饰产物，及它们在血清尿酸测定和应对哺乳动物高尿酸血症相关疾病等方面的 应用。4专利技术概述本专利技术提供来自苛求芽孢杆菌两种可溶性尿酸酶的氨基酸序列和编码它们的 cDNA序列及对两种酶蛋白和其突变体，及这些尿酸酶用聚乙二醇单甲醚进行修饰的方式和 这些对应尿酸酶的应用。同时，本专利技术还提供进行重组表达获得所需要尿酸酶和其突变体 的途径，及对此苛求芽孢杆菌尿酸酶表面的氨基用聚乙二醇单甲醚修饰或将特定位点的中 性氨基酸残基突变成半胱氨酸后对其巯基进行选择性修饰的方式。本专利技术所述来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶都可直接用于临床检验测定血 清尿酸含量；重组表达的此类尿酸酶和其突变体在其N端或C端带有连续的六个组氨酸残 基可作为标签用于亲和纯化；来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶和这些尿酸酶的突变体 重组表达产物都可用于动力学方法或者终点平衡法测定血清尿酸。用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的分子量在2000DaltOn及以上的聚乙二醇单甲醚可在碱性条件下修饰本专利技术所述的天然尿酸酶或重组表达突变体酶蛋白表面的氨基；如是带 有特定位置发生定点突变所生成的半胱氨酸残基的重组表达突变体尿酸酶，就可用聚乙二 醇单甲醚的碘乙酸酯或溴乙酸酯修饰这些巯基从而实现位点特异性修饰。用上述聚乙二醇 单甲醚修饰后的这些尿酸酶及其突变体都可用于治疗和预防哺乳动物，尤其是灵长类动物 高尿酸血症相关的疾病，包括肿瘤溶解综合症和痛风等；在应用中单次给药后体内尿酸在 较长时间内可维持在正常水平，从而有效缓解和预防高尿酸血症相关的疾病。应用实施例实施例1 血清尿酸测定本实施例说明此尿酸酶在直接动力学方法测定血清尿酸中的应用。尿酸酶活性用 75μΜ尿酸在25°C的硼酸钠缓冲液(pH 9. 2)中测定，每分钟氧化一微摩尔尿酸的酶量为一 个单位。(1).反应体系含15μ 1血清，5μ 1重组表达的胞内尿酸酶(>6U/mg，如未声明则 其浓度大于6. OU/ml，在反应体系的终浓度大于0. 0025U/ml)和pH9. 2的硼酸钠缓冲液共 1. 20ml ο(2).测定加入尿酸酶启动反应前体系在293nm的吸收，校正加入酶液的体积效应 (0.3% )和酶制剂吸收(低于0. 004)得酶作用前吸收(AO)。(3).将加入酶后的混合物在石英比色杯内混勻，在加酶30秒后以10到30秒间隔 监测293nm吸收在5min内的变化(最大吸收低于1. 270)，代表性反应曲线如附图1。(4).尿酸消光系数固定为11. 5(mmol -Γ1 κπιΓ1，米氏常数(Km)固定为0. 22mmol/ L (如用来自苛求芽孢杆菌尿酸酶的突变体则需要实验测定其米氏常数)，用以反应时间为 自变量的积分速度方程拟合反应曲线(见附图1)预测本底(Ab)。Atl和Ab之差，S卩ΔΑ，代 表反应体系中尿酸的吸收(详细数据处理方法见中国专利技术专利专利ZL03135649. 4)。实施例2 重组表达苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的聚乙二醇单甲醚5000修饰用分子量为5000的聚乙二醇单甲醚修饰苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶重组表达产物 是其用于哺乳动物体内降低血浆尿酸水平的前提，修饰其氨基的代表性操作过程如下(1).在25°C的0. IM硼酸钠缓冲液中(pH 9. 2)用75. 0 μ M尿酸测定尿酸酶活性。(2).将序列5对应苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶重组表达，Ni-NTA柱亲和层析纯化到 10. OU/mg以上，冻干浓缩到6. Omg/ml后对含有0. IM硼酸钠的缓冲液透析12小时，每4小时更换一次透析外液，直到用2，4，6_三硝基苯磺酸或荧光胺测定无明显的小分子氨基化 合物为止。(2).用分子量为5000的聚乙二醇单甲醚和丁二酸酐生成其羧基衍生物，纯化后 与N-羟基琥珀酰亚胺用二环己基碳二亚胺脱水生成对应的N-羟基琥珀酰亚胺酯，纯化产 物。(3).测定透析后无氨基化合物的重组胞内尿酸酶的蛋白浓度，按编码序列对应分 子量计算其所含氨基数量，按照摩尔当量比值递增方式逐步增加N-羟基琥珀酰亚胺酯活 化的聚乙二醇单甲醚5000量，然后在pH9. 0的硼酸钠缓冲液中混勻，室温反应3小时后取 样测定剩余的尿酸酶活性；反应体系活化聚乙二醇单甲醚5000量对修饰后剩余酶活性的 影响如附图2。(4).将聚乙二醇单甲醚修饰的此重组表达胞内尿酸酶对生理盐水多次换液透析 后备用。实施例3 离体人血浆中聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的降 尿酸作用用离体血浆中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
两种尿酸酶蛋白，所述这两种尿酸酶蛋白中天然酶蛋白都是来自苛求芽孢杆菌的同四聚体单纯蛋白质，都可用分子氧催化尿酸氧化并生成过氧化氢。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖飞，赵运胜，杨晓兰，李想，张纯，冯娟，卜友泉，谢燕玲，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]