以稳定的形式使用和储运金属蛋白酶的方法技术

以稳定形式使用和储运金属蛋白酶的方法，其中在含蛋白酶的水溶液或淤浆中存在或加入Ｎ－保护氨基酸；以及因Ｎ－保护氨基酸的存在而稳定化的金属蛋白酶组合物。效果：金属蛋白酶的失活受到抑制，酶的热稳定性和储存稳定性得特别明显的改进。当上述酶被用于Ｎ－保护氨基酸与氨基酸酯之间的偶合反应时，金属蛋白酶的回收率因ＮＰＡＡ的存在而获改善。在糖精的生产中用Ｎ－苄氧羰基天冬氨酸做为Ｎ－苄基氧羰基氨基酸，并苯基丙氨酸甲酯作为氨基酸酯时，这种效果最为显著。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体地说，以含酶水溶液形式使用和储运该种酶的方法。本专利技术同时还涉及稳定化的酶组合物。蛋白酶可用于种类食品工业和洗涤剂领域。在以水溶液或淤浆形式使用蛋白酶的场合，已知的是，由于自发的自溶或变性作用(pH及温度等)，酶损失其活性。最近，已开发出一种合成二肽甜味剂aspartame的方法，该方法利用由(中性)金属蛋白酶，例如“嗜热菌蛋白酶”(由Daiwa化学公司生产)(见诸于K.Oyama，Bioindustry，Vol2，No.9，5-11页，1985)所催化的缩合反应。因此，蛋白酶，尤其是金属蛋白酶已经成为工业领域中重要的肽合成酶。但是，当以水溶液或淤浆形式被使用或存放长时间之后，这些酶不稳定。(金属)蛋白酶通常以粉末状在商业市场上出售。由于当酶粉末粘附倒喉或眼的粘膜上时，会引起相应部位的炎症，而粉状酶又易形成气溶胶，故而就引起了一个安全问题。另外也可能出现变应原效应。因此，近来从操作安全性考虑，(金属)蛋白酶均做成溶态产品或淤浆使用。然而由于酶自身的稳定性，此种液态酶或酶淤浆在使用和储运当中必须处于低温下操作，这通常导致成本较高(低温储存、活性较低等因素)。况且，当金属蛋白酶用于N-苄氧羰基-L-天冬氨酸(以下称做“Z-Asp”)与L-或DL-苯基丙氨酸甲酯(以下称做“PM”)之间的偶合反应(这是生产α-L-天冬酰-L-苯基丙氨酸甲酯(以下称做“Aspastame”或者“APM”)的一种方法)时，活性酶浓度下降的现象，除酶的稳定性问题之外，还由于酶吸附于N-苄氧羰基天冬酰-苯基丙氨酸甲酯(以下称“Z-APM·PM”，例如“Z-APM·DPM”)加成产物晶体表面所造成。在金属蛋白酶，例如由热蛋白分解素杆菌ROKKO生产出的“嗜热菌蛋白酶”，以溶液或其淤浆形式储存或使用的情况下，已知道，若无一定浓度钙离子存在，该种酶将迅速失活。然而当有钙离子存在时，由于生成碳酸钙，在导管和罐的各部位可能出现结垢，这往往在酶的实际使用中具有显著的有害影响。本专利技术要达到的目的在于提供一种以稳定、不结垢形式使用和储运金属蛋白酶或类似蛋白酶的方法，同时还提供此类稳定的蛋白酶组合物。本专利技术欲达到的进一步目标是提供一种提高回收率的方法，这是通过抑制酶在反应产物晶体(Z-APM·(D)PM)上被吸附来达到的。按本专利技术，存在或添加一种N-保护氨基酸(以下称为“NPAA”)对于防止金属蛋白酶失活，尤其显著改进酶的热稳定性和储存稳定性颇为有效。特别值得指出，已发现N-苄氧羰基-氨基酸(以下称为“NZAA”)的效果是显著的。此外，根据本专利技术，借助NPAA的存在或添加，即使没有过量钙离子存在，金属蛋白酶也可以获得显著的稳定化。如此说来，本专利技术目的的达到在于，在含蛋白酶的水溶液或淤浆中存在或加入N-保护氨基酸。另外，由于在淤浆存在下搅拌作用引起的金属蛋白酶的失活，借助NPAA的存在或加入也显著受到抑制，此乃另一个特点。而且，根据本专利技术，当金属蛋白酶用于Z-Asp与PM之间的偶合反应时，NPAA的存在可使该酶显著稳定化，从而使回收率显著提高。具体地说，本专利技术可以被有利地用于，在NPAA存在下储存或运送金属蛋白酶溶液或淤浆，或者在氨基酸酶催化偶合，特别在aspartame制备过程中利用这种效应。根据本专利技术，因少量NPAA的存在，金属蛋白酶的储存稳定性及其回收率均可显著地改善。相应地，这类酶在储存当中活性降低是极端轻微的，以致于该酶不仅可能长期使用或储存，而且也可以达到提高金属蛋白酶的回收率。这对于处理昂贵的酶在经济上尤其有利。下面，将详细说明本专利技术。打算用本专利技术方法处理的金属蛋白酶并无特定限制，但是对于嗜热菌蛋白酶类(中性)蛋白酶尤为有效。做为一种金属蛋白酶举例说由蛋白水解杆菌或硬脂酸嗜热杆菌产生的，或者通过其表达基因在其他宿主内产生的(金属蛋白酶)。用于本专利技术的酶溶液或淤浆可以是含许多杂质的粗制品或是提纯的制品。在本专利技术方法中用作稳定添加剂的NPAA可以呈盐形式，例如NPAA的钠盐，或呈NPAA的结晶形式。如果希望的话，也可以使用含各种NPAA的溶液或淤浆，或者一种包括各种NPAA的混合物。总之，对NPAA并无特殊限制。NPAA造成的效果丝毫不因其中含有诸如其他氨基酸之类的有机物质或无机物质而变差。NPAA中的AA部分可以全部为天然L-氨基酸，但也可以为D-氨基酸;AA中的酸基团也可以呈酯基形式，例如苄酯。做为NPAA的N-保护基团，例如苄氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(BOC)、甲酰基(F)、对-甲氧基苄氧羰基(pMZ)均适用。特别是，苄氧羰基保护的氨基酸(ZAA类)据发现展示出极为出色的稳定效应。在50℃下存放5小时，在有HZAA存在下，酶的保持率可高达90%或更高，然而当没有它的情况下，仅为约32%。作为NZAA的例子，可举出N-苄氧羰基-L-天冬氨酸(也称为Z-Asp)(其中氨基酸为L-天冬氨酸)、N-苄氧羰基-L-谷氨酸(以下称之为Z-Glu)(其中氨基酸为L-谷氨酸)、N-苄氧羰基-L-苯基丙氨酸(以下称为Z-Phe)(其中氨基酸为苯基丙氨酸)以及N-苄氧羰基甘氨酸(以下称为Z-Gly)(其中氨基酸为甘氨酸)。在含有过量钙离子的体系中，当没有NPAA，储存条件为40℃、5小时情况下，酶的保持率为约44%。然而，在同样体系中，通过加入NPAA，金属蛋白酶失活受到显著的抑制。特别是，当系统中加入NZAA时，几乎不发生蛋白酶失活。这个结果显示由于NPAA的存在，金属蛋白酶溶液在储存当中极为稳定，或可在室温或更高温度下长期使用。故而，在处理和储运昂贵酶时，加入NPAA具有很高的经济价值。根据本专利技术，在储运中即使没有过量钙离子，金属蛋白酶也是很稳定的。所以说，本专利技术对于防止因钙离子引起的麻烦，例如结垢问题，也是有利的。这里可以提到，JP-A-6226989述及通过加入一定量可逆抑制剂，例如抑糜蛋白酶或Z-Phe，可使用于洗涤剂的碱蛋白酶稳定化。然而本专利技术却观察到，将NPAA加入到其他蛋白酶，例如番木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或枯草溶菌素中(所有这些均不是金属蛋白酶)(根据当前的技术，它们可以用于酶催化APM合成)，并不导致任何显著的酶稳定化作用。况且，当金属蛋白酶用于Z-Asp与PM之间的偶合反应时，酶回收率的降低，通过在酶水溶液或淤浆中NPAA的存在，可以获得非常明显的改善。根据本专利技术为了酶的储存和运送，金属蛋白酶水溶液或淤浆中含有的NPAA克分子浓度，应为上述酶浓度的30倍以上，较好为该酶的50倍以上。另一方面，当金属蛋白酶用于Z-Asp和PM之间的偶合反应，而Z-Asp又当作NPAA使用时，在偶合反应后酶的水溶液或淤浆中应存在的Z-Asp克分子浓度应为上述酶浓度的500倍以上，且较好为上述酶的1000倍以上。一般，这意味着Z-Asp浓度应高于15毫克分子/升，较好高于30毫克分子/升。在Z-Asp与PM之间的偶合反应中，当偶合反应后存在于酶的水溶液或淤浆中Z-Asp浓度为50毫克分子/升(克分子浓度1724倍于酶浓度)时，酶的回收率约为90%。另一方面，偶合反应后酶的水溶液或淤浆中存在的Z-Asp浓度为10毫克分子/升(克分子浓度为345倍于酶浓度)时，酶的回收率仅约为50%。如上面所述，当酶用于Z-Asp与PM之本文档来自技高网...

【技术保护点】
以稳定形式使用和储运金属蛋白酶的方法，其特征在于，在含该蛋白酶的水溶液或淤浆中，存在有或外加入Ｎ－保护氨基酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：原田恒夫，国泽幸男，小山清孝，JCM施米斯，高菅修哉，WJJ范登特里尔，
申请(专利权)人：荷兰加甜剂公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]