微生物制备芳族氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及微生物制备来自芳族代谢物质的方法；尤其是制备芳族氨基酸的方法。另外，本发明专利技术涉及基因结构和转化细胞。按照本发明专利技术，通过引入或增加葡糖脱氢酶的活性，观察到物质产量的增加，特别是芳族氨基酸产量的增加。增加氧化葡萄糖的酶的活性导致由含葡萄糖底物于细胞内形成葡糖酸内酯和葡糖酸。在一个优选的实施方案中，所述葡糖脱氢酶来自巨大芽抱杆菌、按照本发明专利技术的方法可以用于提供广谱的物质。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物制备来自芳族代谢的物质的方法，涉及基因结构和转化细胞。随着例如对氨基酸的需求持续增加，通过微生物制备的来自芳族代谢的物质，特别是芳族氨基酸，有巨大的经济利益。因此，例如L-苯丙氨酸用于制备药物，尤其是也用于制备增甜剂天冬苯丙二肽酯(α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)。需要L-色氨酸作为药物和作为饲料的添加剂；对于L-酪氨酸，也同样有作为药物以及作为制药工业中的原料的需要。除了从天然材料中分离外，用生物技术制备也是在经济许可的条件下获得所需光活性形式的氨基酸的一种很重要的方法。或者使用酶法，或者使用微生物实现生物技术制备。后一种制备方法即微生物制备享有以下优点即可以使用简单和价廉的原料。然而，尽管在细胞中氨基酸的生物合成以各种各样的方式控制，人们已经进行了许多不同的尝试，以增加产物生成。因此，例如为了切断生物合成的调节，使用了氨基酸类似物。例如，通过选择对苯丙氨酸类似物的抗性，获得了大肠杆菌(E.coli)的突变体(GB-2,053,906)，使得有可能获得L-苯丙氨酸的产量增加。相似的策略也产生了棒状杆菌属(Corynebacterium)(JP-19037/1976和JP-39517/1978)和芽孢杆菌属(Bacillus)(EP-0,138,526)的过量生产菌株。而且，已知使用重组DNA技术构建的微生物，通过克隆并表达编码不再受反馈抑制的关键酶的基因，在所述微生物中同样消除了生物合成的调节。作为模型，EP-0,077,196描述了一种生产芳族氨基酸的方法，其中在大肠杆菌中过量表达不再受反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸合酶(DAHP合酶)。EP-0,145,156描述了一种大肠杆菌菌株，其中为了生产L-苯丙氨酸，另外过量表达分支酸变位酶/预苯酸脱水酶。上述策略共有的特征是用于提高产量的干涉限于对芳族氨基酸特有的生物合成途径。然而，为了更进一步增加产量，必需努力提高生产芳族氨基酸所需的初级代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(Ery4P)的供给。PEP是糖酵解产物丙酮酸盐(丙酮酸)的活化前体；Ery4P是戊糖磷酸途径的中间体。许多不同的用于增加产量的这些尝试都致力于克服对胞质合成氨基酸的限制。在芳族氨基酸的生产中，需要初级代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和Ery4P两者缩合，以形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。所述文献描述了一些增加Ery4P可得性的策略，例如通过过量表达转酮酶，使得增加Ery4P的供给，并因此增加L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸产物的生成成为可能(EP专利申请第0 600 463号；Frost和Draths,Ann.Rev.Microbiol.49(1995)557-579)。近来证实(Flores等，Nature Biotechnology 14(1996)620-623)，大肠杆菌的PTS-阴性突变体的自发葡萄糖-阳性回复体通过GalP系统将葡萄糖集中到细胞中，并能够在葡萄糖中生长。转酮酶基因tktA的额外表达导致观察到的中间体DAHP的生成增加(Flores等，Nature Biotechnology 14(1996)620-623)。在2个德国专利申请(参考号码为DE 196 44 566.3和DE 196 44567.1，还没有公开)中申请人证实，例如通过在大肠杆菌中增加转醛酶酶活性或增加转醛酶和转酮酶的酶活性，或通过在大肠杆菌中增加葡糖激酶的活性，或通过在大肠杆菌中增加葡糖激酶和PEP不依赖性糖转运系统的活性，或通过组合上述提及的酶和转运系统，可能以更大量生产出苯丙氨酸。本专利技术的目的是利用另外的方法，通过它增强来自芳族代谢的物质的微生物的合成。也要构建一种微生物，在所述微生物中增加了来自芳族代谢的物质的生成。令人惊奇的是，在生产来自芳族代谢的物质的微生物中，通过增强氧化葡萄糖的酶的活性来转化葡萄糖或含葡萄糖底物，实现了上述目的。由此提供了一种替代的代谢途径。该途径包括将游离的葡萄糖氧化成葡糖酸内酯/葡糖酸，并将葡糖酸磷酸化以形成6-磷酸葡糖酸。该结果特别令人惊奇，因为仅仅增加氧化葡萄糖的酶的活性在生产来自芳族代谢的物质中起重要作用决不是不证自明的。在本专利技术的含义中，来自芳族代谢的物质被理解为通过增加Ery4P或Ery4P和PEP的供给有利于其生化合成的所有化合物。例如芳族氨基酸、靛蓝、吲哚乙酸、己二酸、黑色素、莽草酸、分支酸、醌和苯甲酸，也包括它们的潜在衍生物和次级产物。在本文中应当注意，除了需要按照本专利技术的干涉之外，也需要对生产物质的微生物进一步遗传改变，用于制备靛蓝、己二酸和其它非天然的次级产物(Frost和Draths,Ann.Rev.Microbiol.49(1995)557-579)。生产来自芳族代谢的物质的微生物可以以各种方式代谢葡萄糖或含葡萄糖底物(即包含葡萄糖的二糖和寡糖)例如已知用ATP依赖性激酶(己糖激酶和葡糖激酶)磷酸化葡萄糖，并因此将葡萄糖集中于糖酵解中。另外许多细菌具有可利用的PEP依赖性系统，用于摄取葡萄糖并使其磷酸化。葡萄糖也可以被各种可溶性酶或膜结合酶氧化(通过葡糖酸内酯氧化成葡糖酸)。这些酶包括氧化葡萄糖的酶或葡糖脱氢酶。氧化葡萄糖的酶将葡萄糖氧化成葡糖酸内酯，同时还原分子氧。而葡糖脱氢酶也将葡萄糖氧化成葡糖酸内酯，它们使用诸如吡咯并喹啉醌(PQQ)的其它电子受体或诸如烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD)或NADP的其它辅因子。已知膜结合葡糖脱氢酶可以用辅因子吡咯并喹啉醌(PQQ)氧化葡萄糖，反应在所述膜外侧发生。为了将产物(葡糖酸内酯或葡糖酸)摄取到细胞中，就需要一个如已经描述于van Schie等，Journal ofBacteriology 163(1985)493-499；Isturiz等，Journal of GeneralMicrobiology 132(1986)3209-3219；Izu等，Journal of Molecular Biology267(1997)778-793的特殊的转运系统，通常(例如在大肠杆菌中)其表达因葡萄糖的存在而受阻遏，这描述于Izu等，Journal of MolecularBiology 267(1997)778-793和Conway.FEMS Microbiology Reviews103(1992)1-27。于细胞中发现的使用辅因子NAD或NADP的葡糖脱氢酶是可溶性酶。已知的生产者包括芽孢杆菌属菌株，其中一些具有几个葡糖脱氢酶的异构酶(例如在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中的葡糖脱氢酶Ⅰ至Ⅳ；Mitamura等，1990,Journal of Fermentation andBioengineering 70,363-369)。葡糖脱氢酶的表达是受严格调节的，并已知例如仅在芽孢杆菌属菌种的内孢子形成过程中的前孢子阶段发生；与在葡萄糖中生长相关的葡糖脱氢酶的生理作用还不清楚，这已由Lampel等，Journal of Bacteriology 166(1986)238-243和近来的Steinmetz或Foffnagel(“Bacil本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于微生物制备来自芳族代谢物质的方法，其中在生产这些物质的微生物中由于增加氧化葡萄糖的酶的活性而转化含葡萄糖底物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M克雷默，M卡卢茨，G斯普伦格，H萨姆，
申请(专利权)人：荷兰加甜剂公司，于利奇研究中心有限公司，DSM生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]