使用微生物生产天冬氨酸族氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及使用重组微生物生产源自天冬氨酸的氨基酸及其前体、特别是生产L-赖氨酸的方法。此外，本发明专利技术涉及一种重组微生物，以及这种微生物在生产所述氨基酸及其前体和衍生物中的应用，特别是在L-赖氨酸的合成中的应用；该重组微生物与初始微生物相比，具有改善的天冬氨酸来源的氨基酸合成活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种使用重组微生物生产天冬氨酸族氨基酸、特别是L-赖氨酸及其前体的方法。此外，本专利技术还涉及一种重组微生物，以及这种微生物在生产天冬氨酸族氨基酸、特别是L-赖氨酸及其前体中的应用，该重组微生物与其初始微生物相比，具有改造的天冬氨酸族氨基酸合成途径。
技术介绍
氨基酸和它们的衍生物是制药行业中的重要前体，它们被加入至广泛多种的食物和饲料中作为补充物。几种氨基酸，如谷氨酸、赖氨酸和苏氨酸使用它们天然生物合成途径生产。在天然氨基酸生物合成中，氨基酸天冬氨酸作为生产其它氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的前体。具有900，000t/a的世界市场，必需氨基酸L-赖氨酸是最重要的生物技术发酵产物之一(Kohl和Tauch，2009)，它主要是作为动物饲料的补充物(Anastassiadis，2007)。向这样的饲料材料中补充大量的赖氨酸导致如猪或鸡的优势生长。过去的几十年中，白肉消费的持续增长已经导致对赖氨酸的需求增加。可以通过例如发酵方法生产赖氨酸。对于这个目的，已经证明一些微生物如谷氨酸棒杆菌(C. glutamicum)是特别合适的。发酵作为工业生产氨基酸的技术随着分泌谷氨酸细菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的发现而出现。在发现它的几年间，第一批分泌赖氨酸的谷氨酸棒杆菌突变体用于大量生产(Kinoshita等，1961)。研究工作继续朝向新的技术以建立高效发酵，包括优化发酵过程、下游加工以及菌株改造。常规地，菌株通过重复过程的用UV光或化学诱变剂进行随机突变和后续菌株筛选而制造。在这些过程中，成功的关键是使用有毒的赖氨酸类似物如S-(2-氨乙基)半胱氨酸来选择反馈抑制菌株(Nakayama和Araki, 1973)。这些常规菌株代表性地共享天冬氨酸激酶基因中的点突变，这些菌株由于赖氨酸和苏氨酸的反馈抑制而释放编码的酶(Kalinowski等，1991 ;Thierbach等，1990)。通过这些常规来源的菌株,可以实现显著的生产性质，如达到50%的转化率和IOOg I/1的赖氨酸 Cl的滴定度(Leuchtenberger等，2005)。但是，这代表性地与2-3天的广泛的发酵时间相联系，限制了生产力。此外，由在菌株生长中积累的不期望突变所产生的营养缺陷型和弱的胁迫耐受度(Ohnishi等，2002)，进一步展示了常规生产菌株的严重劣势。在近几年中，重组DNA技术和分子生物学开启了菌株工程的新纪元一通过代谢工程合理优化(Ikeda等，2006)。许多这些研究已经聚焦于通过直接改造赖氨酸生物合成途径的酶而优化赖氨酸生物合成的通量。现在，从反馈控制释放天冬氨酸激酶被认为是工业生产菌的最重要性质之一。除了关于途径调节的改造之夕卜，生物合成途径的速率决定酶的细胞内活性也是菌株改造的关键点。增加细胞内酶活性的策略包括通过使用更强的启动子、突变启动子序列或基因上游调控区、或增加编码基因的拷贝数而过表达。在本文中，质粒相关的过表达适于实现更高的酶活性和更好的赖氨酸产量(Eggeling，1998)，但几乎无法在工业生产中应用。鉴定除了生物合成途径本身之外的有益目标不久变得对于消除向竞争性生产菌的产生提供前体和辅因子中的瓶颈是必要的。但是，这更加具有挑战性和难度，因为它需要在系统水平理解生物体。在这点上，谷氨酸棒杆菌基因组序列的可用性成为代谢工程的里程碑(Haberhauer 等，2001 ；Kalinowski 等，2003 ；0hnishi 等，2002 ；Pompejus 等，2002)。它提供了以下基础(i)通过对常规产生的生产菌和野生型菌进行比较性序列分析而完善基因组(Ohnishi等，2002)，(ii)详细的经由硅芯片计算机的谷氨酸棒杆菌的代谢网络改造(Kjeldsen和Nielsen, 2009),包括化学计量模式方法以分析理论生产能力以及涉及的代谢途径(Kr6mer等，2006 ;Wittmann和Becker，2007)，以及(iii)通过基因组内的特定序列基序的方式发现转录调节网(Kohl和Tauch，2009)。但是，作为理解系统的关键特征和菌株设计的指导，这些模式不能用于预测体内代谢途径的活性，即通量组。通量分析是 代谢工程的中心要素(St印han0p0Ul0S，1999)，如通过重要过程所显示的以评估体内代谢流(Christensen 和 Nielsen,2000 ；Christensen 等，2000 ；Frick 和 Wittmann, 2005 ；VanDien 等，2006 ；ffittmann, 2007 ；ffittmann 和 Heinzle, 2002)。除了观察生物系统之外，13C代谢流分析已经证明对于菌株表征和用于赖氨酸生产的有益目标的鉴定是有用的(Kiefer等,2004 ;Wittmann和Heinzle, 2002)。与从测定活性系列的基因(转录组)(Hayashi等，2006)和蛋白(蛋白组)(Bendt等，2003)和从量化细胞内代谢水平(代谢组)(Borner等，2007)所获得的补充发现一起，提供了扩展数据系列以在全球水平获得对细胞生理学的深度观察。该系统导向的方法展示了对于代谢工程极好的平台(Lee等，2005)。在20世纪50年代日本的大量筛选程序中发现了主要的生产赖氨酸微生物谷氨酸棒杆菌。使用反复过程的随机突变和筛选改进的生产特征对菌株进行连续的赖氨酸生产优化。这产生了有效的生产菌，但也导致了引起生长减弱、弱的胁迫耐受性或增加营养需要的副突变的累积。因此，对于谷氨酸棒杆菌，目前获得的生产性能明显低于预测的理论能力。现在，分子生物学和用于分析细胞的代谢和调节状态的系统导向方法的进步将菌株改造转变成更加精确和目标优化的系统代谢工程。这个的目标在于具有表现出增加的产量、滴定度和生产力的完整系列的有益修饰的高产菌。在过去，已经做过多种尝试使用微生物增加L-赖氨酸的生产。通过上调和/或下调涉及甲硫氨酸或赖氨酸生物合成的基因的表达来增加如甲硫氨酸或赖氨酸的生产的常规尝试在如 W002/10209、W0 2006/008097 和 WO 2005/059093 中描述。之前在谷氨酸棒杆菌中鉴定的中心分解代谢网包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径(PPP)、三羧酸(TCA)循环和乙醛酸支路。WO 03/042389涉及一种遗传改良的微生物，其中G6H)基因(zwf)已经引入至该微生物中，或该微生物中的G6ro基因已经改良；还涉及该微生物在制备目标化合物如氨基酸(特别优选的是赖氨酸)中的应用。WO 0220542涉及一种发酵制备L-氨基酸、特别是L-赖氨酸的方法，其中使用如增强的gap2基因至少部分地排除了减少期望的L-氨基酸形成的代谢途径。同样提及了长列表的可以被修饰的其它基因。EP 0435132公开了棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物,所述微生物包含重组DNA并适于获得氨基酸,特别是L-赖氨酸。所述DNA序列特别源自于棒状杆菌属或短杆菌属的生产L-赖氨酸的菌，优选地源自于通过谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的突变获得的突变体，所述谷氨酸棒杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：C·维特曼，J·贝克尔，
申请(专利权)人：白光产业株式会社，
类型：发明
国别省市：