人工水蛭蛋白酶抑素及其编码基因与该基因的高效表达方法技术

本发明专利技术公开了一种人工水蛭蛋白酶抑素及其编码基因与该基因的高效表达方法，本发明专利技术提供的水蛭蛋白酶抑素，是具有序列表中序列４氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列４的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列４的氨基酸残基序列相同活性的由序列４衍生的蛋白质。水蛭蛋白酶抑素的编码基因，是下列核苷酸序列之一：１）序列表中序列１的ＤＮＡ序列；２）与序列表中序列１限定的ＤＮＡ序列具有９３％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的ＤＮＡ序列。本发明专利技术的水蛭蛋白酶抑素具有高效特异地抑制弹性蛋白酶活性的作用，在酸碱状态下状态稳定，对于开发新的具有抑制弹性蛋白酶活性的药物具有重要意义。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域中。
技术介绍
弹性蛋白酶是一种降解胶原、软骨等组织内弹性蛋白的酶，又称人白细胞弹性蛋白酶。当中性白细胞在体内遇到异物时，释放弹性蛋白酶，水解并灭活异物，保护人体的正常生理功能。但在某些病理状态下，中性白细胞也可向正常组织释放该蛋白酶，导致正常组织的破坏，如牛皮癣的皮损，肺气肿的肺泡破裂，类风湿性关节炎的关节软骨面损伤。除此之外，弹性蛋白酶也有一部分来自于胰腺，分泌进入消化道，帮助食物的消化吸收，当急性或慢性胰腺炎时，弹性蛋白酶可释放进入周围组织和腹腔，导致急慢性炎症，因此，寻找一种高效而特异的弹性蛋白酶抑制，对多种疾病的防治意义重大。Jung H.H.等人于1995年在水蛭体内分离出一种弹性蛋白酶抑制剂，命名为水蛭蛋白酶抑素，可高效特异地抑制弹性蛋白酶活性，无论特异性，还是活性均优于市售产品，并且在酸碱状态下均很稳定，因此采用基因工程手段，实现水蛭蛋白酶抑素的体外高效表达，对该蛋白的进一步开发并进行规模化生产，意义重大。毕赤酵母表达系统是用于表达外源蛋白的最成功的表达系统之一，近年来发展非常迅速，目前已有几百种蛋白在该表达系统中得以表达。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母菌，其生长迅速，培养条件简单，可以高密度连续培养，遗传操作与酿酒酵母相似，技术已相当成熟，是工业生产中常用的高表达菌种。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的人工合成的水蛭蛋白酶抑素及其编码基因。本专利技术提供的水蛭蛋白酶抑素，是具有序列表中序列4氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。序列表中序列4的蛋白质由57个氨基酸残基组成。本专利技术选用了毕赤酵母菌优选密码子，并用计算机模拟计算了翻译起始区和水蛭蛋白酶抑素基因5’端二级结构最小生成自由能，设计并合成了水蛭蛋白酶抑素基因序列。水蛭蛋白酶抑素的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有93％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由174个核苷酸组成，编码序列表中序列4的蛋白质。含有本专利技术水蛭蛋白酶抑素基因的表达载体、细胞系均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第二个目的是提供一种高效表达上述人工合成的水蛭蛋白酶抑素基因的方法。为实现这一目的，本专利技术采用以下技术方案水蛭蛋白酶抑素基因的高效表达方法，是将上述人工合成的水蛭蛋白酶抑素基因导入到毕赤酵母菌中，表达获得水蛭蛋白酶抑素，具体的说包括以下步骤1)合成水蛭蛋白酶抑素基因序列；2)将合成的基因片段与载体pPIC9K连接，得到表达质粒，转化毕赤酵母菌后获得表达工程菌；3)培养工程菌，表达产物分泌到培养液中，获得目标蛋白。为了使表达更加高效，毕赤酵母菌的表达过程中用甲醇进行诱导。诱导过程中的甲醇终浓度优选为1％-5％。用本专利技术的方法得到的水蛭蛋白酶抑素占培养液总蛋白的94.6％以上，表达过程操作简单，产品成本较低，可用于规模化生产。本专利技术的水蛭蛋白酶抑素具有高效特异地抑制弹性蛋白酶活性的作用，在酸碱状态下状态稳定，对于开发新的具有抑制弹性蛋白酶活性的药物具有重要意义。附图说明图1为本专利技术水蛭蛋白酶抑素PCR扩增后的电泳图谱。图2为载体pGEM-ACP2的图谱。图3为pGEM-ACP2表达质粒的图谱。图4为pGEM-ACP2表达质粒酶切凝胶电泳图谱。图5为诱导前后培养液电泳图。图6为目标产物的活性鉴定。具体实施例方式实施例1、表达基因的合成1、小片段的人工合成将序列1水蛭蛋白酶抑素基因分为二段，第一段序列为cDNA正链，第二段序列为cDNA互补链。在第一段的3’端外加8个与第二段3’互补的碱基，总长105个碱基，为序列表中的序列2，在第二段的3’端外加8个与第一段3’端互补的碱基，总长111个碱基，为序列表中的序列3。在两片段5’端分别加上NdeI和NotI酶切位点，用DNA合成仪合成。将DNA合成仪合成的片段，用单一循环的PCR反应连接合成序列1的全序列水蛭蛋白酶抑素基因，如图1所示，证明得到的序列正确。实施例2、水蛭蛋白酶抑素体外表达1、切取该PCR片段，装入pGEM-T-EASY质粒内，构建pGEM-GUM克隆载体，其结构图谱如图2所示。2、pGEM-GUM表达质粒的构建采用购自美国Invitrogen公司的高效表达质粒pPIC9K，用NdeI和NotI分别酶切pGEM-GUM质粒和pPIC9K质粒，凝胶电泳收集目标片段，用T4连接酶16℃过夜连接。经常规方法的转化，挑菌，扩增获得表达质粒pGEM-GUM，其结构图谱如图3所示。如图4所示，酶切鉴定，证明表达质粒的结构正确。3、将质粒pGEM-GUM用SacI线性化。采用浙江新芝公司电基因导入仪，将线性化的pGEM-GUM导入GS115毕赤酵母菌(购自Invitrogen公司)内，经培养，挑选，筛选等过程，获得抗G418mg/ml的单克隆菌。4、挑选单克隆菌，接种于5ml培养基中，30℃过夜，然后转入250ml培养基中，继续培养至OD600＝10-20，收集菌体，用无碳源培养基稀释至OD600＝50，继续培养24小时，加入甲醇至终浓度为2％诱导表达，每隔24小时加甲醇一次，至96小时。离心取上清液，进行凝胶电泳分析和功能测定。取10ml上清液，用12％SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮兰染色。结果可见，在6KD的位置，有诱导的蛋白表达，并根据BSA对照，估测表达量为103mg/L。在本实施例中，培养单克隆菌体时用甲醇进行诱导意义很大，在没有诱导之前，培养液中目标蛋白的含量很低，如图5所示，诱导后的培养液中有显著的目标蛋白带，大小与序列4的蛋白相同，而诱导前的培养液中没有显著的目标蛋白带。实施例3、本专利技术水蛭蛋白酶抑素的功能测定取5支试管，分别标为磷酸缓冲液、诱导前上清、诱导后上清1、上清2、上清3，依次分别加入40ul 0.2M Tris-HCl，pH8.0，20ul 0.37mg/ml猪胰腺弹性蛋白酶(SIGMA，E-1250)，然后按试管上的标签分别加入40ul磷酸缓冲液、诱导前上清或诱导后上清，混匀，再加入400ul 0.1mM反应底物SucA3PNA(SIGMA)，室温反应10分钟后，在410nm处比色，以磷酸缓冲液作比较，计算酶活性抑制百分率，计算公式为OD410测定样/OD410磷酸缓冲液。结果如图6所示，诱导前上清与磷酸缓冲液组无明显差异，而诱导后上清的酶活性抑制百分率为99％。表明表达产物即为水蛭蛋白酶抑素，并有良好的弹性蛋白酶抑制作用。序列表<160>4<210>1<211>174<212>DNA<213>人工序列<220> <223> <400>1gttgacgaaa acgctgaaga cacccatggt ttgtgcggtg aaaaaacctg ctctccagct 60caagtctgtc taa本文档来自技高网...

【技术保护点】
水蛭蛋白酶抑素，是具有序列表中序列２氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列２的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列２的氨基酸残基序列相同活性的由序列２衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凤鸣，
申请(专利权)人：刘凤鸣，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]