一种检测脂质过氧化物的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测脂质过氧化物的方法，目的是提供一种具有较高稳定性、灵敏度及特异性的检测脂质过氧化物的方法。本发明专利技术检测脂质过氧化物的方法，是利用抗脂质过氧化物和抗非过氧化脂质的单克隆或多克隆抗体配对进行样品中脂质过氧化物ｏｘＬＤＬ和ＭＤＡ－ＬＤＬ的测定。利用本发明专利技术的方法检测脂质过氧化物既可以基于酶联免疫法的原理，又可以基于免疫纸层析法的原理。本发明专利技术的方法提高了对血液和脂质样品中过氧化物检测的可行性，并大大降低了该检测中的配对抗体筛选的复杂性，具有重要的实际应用意义。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
氧自由基是人体白细胞用来抵御外来入侵的有力工具，但在某些状态下，它也可以导致人体的病理性改变，包括动脉粥样硬化、肺纤维化、肾小球硬化、肝硬化、衰老等。这些病理改变往往是由于体内过量的自由基导致脂质过氧化物在体内聚集所致。最常见的脂质过氧化物有氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和丙二醛氧化型低密度脂蛋白(MDA-LDL)。这些过氧化脂蛋白的形成可导致1)低密度脂蛋白出现自体抗原性；2)对正常低密度脂蛋白(LDL)受体的亲和力降低或消失；3)过多的脂质过氧化物被细胞摄取，而形成泡沫样细胞；4)刺激细胞增值。这些改变的最终结果表现为动脉粥样硬化、肺纤维化、肝硬化等。目前，已有许多临床研究报道证实oxLDL和MDA-LDL在冠心病人血液中的浓度明显高于正常人，同时在个别肾病病人、肝脏疾患、长期大量饮酒者血液中的浓度也高于正常人。部分结缔组织系统疾病患者，如系统性红斑狼疮患者血液中的浓度也有升高。血液脂质过氧化物的测定既有助于疾病的诊断，也是人群健康控制的一种良好检测手段。酶联免疫法和免疫纸层析法是目前用于样品中oxLDL和MDA-LDL浓度的检测方法。一般采用双抗体夹心法，即选用不同的单克隆抗体，对样品抗原进行夹心测定，所用的抗体均为过氧化结构特异性的，即检测oxLDL水平，用抗oxLDL抗体，配对抗oxLDL抗体，检测MDA-LDL水平用抗MDA-LDL抗体配对抗MDA-LDL抗体。这些方法需要选配两个同时对抗脂质过氧化位点，但具有不同的抗原决定簇的抗体，工作量很大，比较复杂，并带有很大程度的偶然性，影响了血液脂质过氧化物水平检测的临床应用。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供一种具有较高稳定性、灵敏度及特异性的检测脂质过氧化物的方法。检测脂质过氧化物的方法，是利用抗脂质过氧化物和抗非过氧化脂质的单克隆或多克隆抗体配对进行样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL的测定。利用本专利技术的方法检测脂质过氧化物既可以基于酶联免疫法的原理，又可以基于免疫纸层析法的原理。在酶联免疫法的测定中包括以下步骤 1)用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL或抗人LDL的单克隆或多克隆抗体包板；2)加入待测样品；3)加入相应的第二抗体，当采用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL单克隆或多克隆抗体包板时，加入的第二抗体为抗人LDL单克隆或多克隆抗体；当采用抗人LDL单克隆或多克隆抗体包板时，加入的第二抗体为抗人oxLDL或MDA-LDL单克隆或多克隆抗体；4)加入与第二抗体对应的酶标抗体进行反应；5)加入底物进行反应；6)确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。所述与第二抗体对应的酶标抗体是以制造第二抗体的动物的IgG为抗原得到的抗体。所述酶标抗体的标记物优选为辣根过氧化物酶；所述底物优选为过氧化氢。优选用酶免测定仪读取450nm波长处吸光率来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。以酶联免疫法为基础的测定样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL含量的具体步骤为1)包被；2)洗板；3)封闭；4)洗板；5)加样；6)洗板；7)加入第二抗体；8)洗板；9)加入酶标抗体；10)洗板；11)加入底物；12)加入终止液；13)用酶免测定仪读取450nm波长处吸光率。在免疫纸层析法的测定中包括以下步骤1)标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或标记抗人LDL的单克隆或多克隆抗体，作为显色抗体；2)用对应的非标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或非标记抗人LDL的单克隆或多克隆抗体包被检测膜，作为捕获抗体；当采用标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL作为显色抗体时，捕获抗体为非标记抗人LDL抗体，当采用非标记抗人LDL作为显色抗体时，捕获抗体为标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL抗体；3)组装检测试纸条4)向显色抗体中加入待测样品，使样品中的抗原oxLDL和抗人MDA-LDL分别与标记的抗人oxLDL和抗人MDA-LDL抗体结合或样品中的抗原LDL与标记的抗人LDL抗体结合并向捕获抗体泳动；5)确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。其中，结合有抗原的显色抗体与捕获抗体结合而显色，其显色强度与结合量相关。通过显色反应确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。一般采用胶体金属显色法进行所述显色抗体标记，其中优选的为胶体金法。所述显色反应确定可采用目测法，即为定性法，或显色密度检测法来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平，也可以用色卡等来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。显色反应确定可采用目测法，即为定性法，或显色密度检测法来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平，也可以用色卡等来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。本专利技术中的抗人oxLDL、抗人MDA-LDL及抗人LDL的单克隆或多克隆抗体均可以按照常规生物学及生物工程学方法制得。本专利技术巧妙地利用抗脂质过氧化物和抗非过氧化脂质的单克隆或多克隆抗体配对进行样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL的测定，实现了利用只有一个抗脂质过氧化位点的单克隆或多克隆抗体配以一抗LDL的单克隆或多克隆抗体，就可夹心测定样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL的水平，提高了对血液和脂质样品中过氧化物检测的可行性，并大大降低了该检测中的配对抗体筛选的复杂性，具有重要的实际应用意义。附图说明图1为酶联免疫检测法不同样品吸收光度的直方图。具体实施例方式实施例1、用脂质过氧化物包板的酶联免疫检测方法检测样品中的脂质过氧化物一、实验材料1、样品制备MDA-LDL的制备取0.2ml 12M HCl，加入0.165ml四甲氧基丙烷，混合，室温静置30分钟，然后加入4.8ml 0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.4)(用10M NaOH调pH)，再与等体积2mg/ml LDL(SIGMA)水溶液混合，37℃水浴2小时。用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)透析过夜(4℃)，终止反应，离心，-20℃保存。oxLDL的制备分别配制1mg/ml LDL(SIGMA)和10mg/ml硫酸铜溶液，按1∶1体积混合，37℃水浴通氧气反应24小时，用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)透析过夜(4℃)，终止反应，离心，-20℃保存。2、酶联反应板96孔板；3、试剂配制试剂来源兔抗人oxLDL多克隆抗体，羊抗人MDA-LDL多克隆抗体，购自美国Biodesign公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔和兔抗羊IgG多克隆抗体购自北京中山生物技术公司，其它试剂均购自北京化学试剂总公司。抗人非过氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的制备过程是采用非过氧化低密度脂蛋白免疫Balb/c小鼠，收集免疫Balb/c小鼠脾细胞，与瘤细胞融合，经筛选和3-5次亚克隆化而获得抗人非过氧化低密度脂蛋白单克隆抗体细胞株，在将该细胞株接种于小鼠腹腔内，使其产生腹水，收集腹水，经蛋白A法纯化而得。包被缓冲液50mM碳酸盐缓冲液，pH9.6；洗涤缓冲液10mM PBS，0.05％Twecn20，pH7.4；底物缓冲液24.3mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，0.015％双氧水邻苯二胺1mg/ml；封闭缓冲液1×磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，pH7.4；稀释缓冲液1×磷酸盐缓冲液，0.25％牛血清白蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测脂质过氧化物的方法，是利用抗脂质过氧化物和抗非过氧化脂质的单克隆或多克隆抗体配对进行样品中脂质过氧化物ｏｘＬＤＬ和ＭＤＡ－ＬＤＬ的测定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凤鸣，
申请(专利权)人：刘凤鸣，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]