核苷酸多态性的检测方法技术

本发明专利技术提供一种可用于检测基因上核苷酸多态性的核苷酸；一种使用该核苷酸检测碱基上核苷酸多态性的方法；以及用于所述方法的试剂盒。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可用于检测基因中碱基置换的核苷酸(供本专利技术方法用的寡核苷酸)、使用所述核苷酸检测基因中碱基置换的方法、以及用于所述方法的试剂盒。
技术介绍
已知属于同一物种的生物个体基因组中所含的遗传密码相互并不相同，在碱基序列中存在差异，被称为多态性。其中一个至数十个碱基缺失或插入的碱基序列、其中特定碱基序列被复制的碱基序列等都被称为多态性。其中一个碱基被另一碱基取代的碱基序列被称为单核苷酸多态性(SNP)。据说单核苷酸多态性以约1/100-1/1000碱基的速率存在。因此，人类基因组上存在的SNP数目估计是3-10×106。注意到SNP作为用于搜索与疾病相关的基因的指标，或者作为用于获得有关对疾病的感病性或对药物的敏感性(作用或副作用)方面差异的信息的指标。用于检测SNP的方法正在研究之中。用于检测SNP的常规方法一般分为基于杂交的方法、基于引物延伸的方法和应用酶的底物专一性的方法。在杂交方法中，通过探针与核酸样品的杂交来检测碱基置换的存在。按照所述方法，必需确定探针和杂交条件，以便使杂交可受仅一个碱基差别的影响。因此，难以建立高度可再现的检测系统。例举应用如美国专利第5,660,988号中所述的循环探针反应来检测突变的方法。在所述方法中，将具有可容易切割的键合的核酸探针与目标核酸分子杂交。如果目标核酸分子没有碱基置换，则探针被切割，反之，如果所述核酸分子有碱基置换，则探针不被切割。碱基置换则通过检测从被切割探针释放的片段的产生程度并对其进行定量来检测。然而，如果依照此方法检测痕量的靶核酸，则可能需要相当长的时间来达到所述方法可以检测到来自探针的切割产物的水平，因为切割产物的量很少。应用如美国专利第5,210,015号和第5,487,972号中所述的TaqMan方法来检测突变的方法是另一方法的例子。在该方法中使用与荧光染料和猝灭剂连接的TaqMan探针。使用两种探针(一种含有碱基置换，而另一种不含碱基置换)作为TaqMan探针。所述探针与目标核酸分子杂交，并且引物从上游开始延伸。只有当目标核酸分子不含碱基置换时，所述探针才由于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性而被切割。碱基置换则通过检测发射的荧光来检测。然而，所述方法有问题，因为所述方法需要具有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶、使用3’末端被封闭的标记核苷酸以及严格的温度调节的PCR，因而检测需要的时间长。其中使用酶的方法包括其中使用DNA聚合酶的方法。这样的方法还分为如下三组(1)其中使用3’末端退火至待检测碱基置换的碱基部分的引物，基于引物延伸反应的存在检测碱基置换的方法，如美国专利第5,137,806号中所述；(2)其中使用其中待检测的碱基置换位点位于从3’末端起第二个核苷酸上的引物，基于引物延伸反应的存在检测碱基置换的方法，如WO 01/42498中所述；和(3)其中使用3’末端退火至邻近待检测碱基置换的碱基的3’碱基上的引物，通过鉴别掺入到引物中的碱基，测定在目标位点上存在突变和所述位点上的碱基的方法。其中使用DNA连接酶的方法是已知的，按照所述方法，碱基置换基于探针与相邻探针连接的存在进行检测。所述探针的末端部分对应于待检测碱基置换的碱基部分。其中使用DNA聚合酶或DNA连接酶的方法可能不能够精确检测出由于碱基置换引起的引物(或探针)和靶核酸之间的错配。具体地说，即使引物或探针有错配，这样的酶也可以起始酶促反应，从而提供错误结果。因为由于靶核酸和引物之间的错误退火引起的可能的假阳性或者由于所使用的连接酶或聚合酶造成的错误，所以必需非常严格地控制反应条件(特别是反应温度)等，因而有涉及可再现性的问题。最后，包括其中使用具有识别和切割双链核酸中特定结构的活性的酶的方法，例如在美国专利笫5,846,717号中所述的侵入者(invader)方法。切割酶已知是这样的酶。通过检查探针的切割来检测碱基置换是可行的。设计所述探针使其形成为所述酶所识别的结构，如果碱基置换存在(或不存在)的话。然而，其中使用具有识别和切割双链核酸中特定结构的活性的酶的方法就其灵敏度而论有问题。具体地说，按照所述方法，由于从不同的靶核酸分子产生一种信号，所以不可能从痕量的核酸样品中获得足以检测出碱基置换的信号。自然，有可能通过重复探针切割反应来增强所述信号，虽然必需预先扩增靶核酸，以便获得强的信号。因此，如果依照此方法检测痕量的靶核酸，则可能需要相当长的时间来达到可以检测到来自探针的切割产物的水平，因为切割产物的量很少。由于所述方法有如上所述的几个问题，因此一直需要可以用来精确检测碱基置换的方法。专利技术目的本专利技术的主要目的是解决上述问题，并且提供即使使用痕量的核酸样品也能精确而极好再现性地检测碱基置换(例如SNP)的方法。专利技术概述为了解决如上所述的问题，需要可以用来精确检测碱基置换并且获得作为强信号的结果的方法。本专利技术人制备了一种核苷酸。所述核苷酸能够退火至待检测碱基置换的靶核酸上。通过DNA聚合酶从其3’末端的DNA延伸反应当所述核苷酸处于完整状态时则不被起始。核酸酶对所述核苷酸的切割受退火的模板链的碱基序列的影响。此外，本专利技术人建立了使用所述核苷酸可以用来精确而高灵敏度地检测靶核酸中碱基置换的方法。因而完成了本专利技术。本专利技术概述如下。本专利技术的第一个方面涉及一种用于检测靶核酸中特定碱基上存在碱基置换的方法，所述方法包括(1)将含有靶核酸的样品与一种核苷酸混合，其中所述核苷酸(A)在3’末端被修饰，致使不发生由DNA聚合酶从所述末端开始的延伸；(B)具有能够退火至所述靶核酸中含有特定碱基的区上的碱基序列；和(C)含有这样的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸构成的复合物中在所述特定碱基和在所述核苷酸中对应于所述特定碱基的碱基之间有错配，则所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定碱基和在所述核苷酸中对应于所述特定碱基的碱基之间没有错配，则所述核苷酸被核酸酶切割，产生一个新的3’末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶处理所述混合物；且(3)检测所述核酸酶有无切割所述核苷酸。以下方法作为第一方面的用来检测碱基置换的方法的例子；其中所述核酸酶为核糖核酸酶H，并且所述核苷酸在含对应于所述特定碱基的碱基的区中含有一个核糖核苷酸的方法；以及其中所述核酸酶为限制性酶，并且所述核苷酸在含对应于所述特定碱基的碱基的区中含有一个限制性酶的识别序列的方法。本专利技术的第二个方面涉及一种用于检测靶核酸中碱基置换的方法，所述方法包括(1)将含有靶核酸的样品与一种核苷酸混合，其中所述核苷酸 (A)在3’末端被修饰，致使不发生由DNA聚合酶从所述末端开始的延伸；(B)具有能够退火至所述靶核酸中含有特定碱基的区上的碱基序列；和(C)含有这样的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸构成的复合物中在所述特定碱基与所述核苷酸中对应于所述特定碱基的碱基之间没有错配，则所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定碱基与所述核苷酸中对应于所述特定碱基的碱基之间有错配，则所述核苷酸被核酸酶切割，产生一个新的3’末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶处理所述混合物；且(3)检测所述核酸酶有无切割所述核苷酸。其中所述核酸酶是一种错配特异性核酸酶的方法为第二个方面的检测方法的例子。在第一个或第二个方面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测靶核酸中特定碱基上存在碱基置换的方法，所述方法包括：（１）将含有靶核酸的样品与一种核苷酸混合，其中所述核苷酸（Ａ）在３’末端被修饰，致使不发生由ＤＮＡ聚合酶从所述末端开始的延伸；（Ｂ）具有能够退火至所述靶 核酸中含有特定碱基的区上的碱基序列；和（Ｃ）含有这样的序列：其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸构成的复合物中在所述特定碱基与所述核苷酸中对应于所述特定碱基的碱基之间有错配，则所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定碱基与所述核苷酸 中对应于所述特定碱基的碱基之间没有错配，则所述核苷酸被核酸酶切割，产生一个新的３’末端；（２）用所述核酸酶和所述ＤＮＡ聚合酶处理所述混合物；且（３）检测所述核酸酶有无切割所述核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：佐川裕章，小林英二，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]