用于鉴定毛冠鹿的特异性PCR引物和方法及其在鉴定毛冠鹿中的应用技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定毛冠鹿(Elaphodus cephalophus)的特异性PCR引物，其中，所述特异性PCR引物包括如SEQ ID No：1所示的引物1，以及如SEQ ID No：2所示的引物2。本发明专利技术还公开了一种利用特异性PCR引物鉴定毛冠鹿的方法，该方法包括：提取待测样品的总DNA并对总DNA进行PCR扩增；将扩增后的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述特异性PCR引物为上述特异性PCR引物，若泳道中出现1条特定长度的条带，则判断所述待测样品为来自毛冠鹿的样品。本发明专利技术还公开了一种上述特异性PCR引物或鉴定方法在鉴定毛冠鹿中的应用。通过设计上述引物，实现了简便易行且经济实用地鉴定毛冠鹿的目的。

For specific PCR primers and identification method and its application in identification of tufted deer in tufted deer

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定毛冠鹿的特异性PCR引物和方法及其在鉴定毛冠鹿中的应用
本专利技术涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于鉴定毛冠鹿的特异性PCR引物及使用所述特异性PCR引物鉴定毛冠鹿的方法，以及它们在鉴定毛冠鹿中的应用。
技术介绍
毛冠鹿(Elaphoduscephalophus)是一种生活于丘陵山地地带的中小型草食性鹿科动物，分类上隶属哺乳纲(Mammalia)、偶蹄目(Artiodactyla)、鹿科(Cervidae)。毛冠鹿主要分布于中国的浙江、福建、安徽、江西、广东、湖南、湖北、四川、云南等地。文献记载在国外的缅甸北部也有分布，但迄今未发现生存个体。因此，毛冠鹿可以被认为是一种特产于我国的珍稀鹿科动物。如同其它鹿科动物，毛冠鹿物种也深受违法盗猎和违法贸易的影响，其种群数量处于持续下降状态。2000年颁布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》将其列为保护物种，2015年新发布的《中国生物多样性红色名录—脊椎动物》更将毛冠鹿列为中国易危(VU)种。加大对毛冠鹿物种的保护及生物学研究已成为广大动物保护工作者的共识。在野生动物的保护及管理工作中，基于分类学的准确物种鉴定是首要的前提。物种鉴定的结果往往是森林公安、工商、边检等行政执法部门开展野生动物资源保护与管理工作的基础。传统的形态学分类方法一直是野生动物鉴定的常用方法，但形态学分类方法固有的一些缺陷也给物种鉴定工作带来了困难，比如表型可塑性和遗传可变性、生物性别和发育阶段限制等。针对鹿科动物的鉴定工作实践表明，由于盗猎者对其皮张及肉的价值攫取，造成送检样品破碎化(样品类型为毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便等，且样品量较小)，从形态学上已无法实现对物种的准确识别。随着聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术在法医学鉴定中的不断应用，以DNA序列分析为代表的分子生物学技术在濒危野生动物鉴定中也得到了广泛的应用。随着聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术在法医学鉴定中的不断应用，以DNA序列分析为代表的分子生物学技术在濒危野生动物物种鉴定中也得到了广泛的应用。因此，提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，同时对样品来源无限制，且可仅通过一次PCR扩增即可快速有效地实现对毛冠鹿物种的精确测定的特异性PCR引物是本专利技术亟需解决的问题。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的在于克服现有技术中通过形态学特征对毛冠鹿物种进行测定的局限性，提供一种简便快捷且经济的用于鉴定毛冠鹿的特异性PCR引物和鉴定毛冠鹿的方法，以及它们在鉴定毛冠鹿中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于鉴定毛冠鹿(Elaphoduscephalophus)的特异性PCR引物，所述特异性PCR引物包括如SEQIDNo：1所示的引物1，以及如SEQIDNo：2所示的引物2。所述特异性引物可以对目标样品进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳的分离结果即有无产生目的扩增产物，来鉴定待检物种。本专利技术还提供一种利用特异性PCR鉴定毛冠鹿(Elaphoduscephalophus)的方法，所述方法包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)采用特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述特异性PCR引物为权利要求1中所述的特异性PCR引物；其中，在步骤(3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中出现1条条带，则判断所述待测样品为来自毛冠鹿的样品，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自毛冠鹿的样品。在本专利技术中，出现的1条条带中所含有的DNA片段的长度为240bp。在本专利技术中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，在PCR扩增过程中，以30μL的PCR扩增体系为基准，引物的浓度优选为0.25-0.5pmol/L。PCR扩增体系指包括引物、Taq酶、dNTPMix、DNA模板(总DNA)、Mg2+以及缓冲液等进行PCR扩增过程所添加的所有试剂和原料。另外，在本专利技术中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，步骤(2)中PCR扩增用总DNA的用量为45-55ng。其中，用于PCR扩增的DNA聚合酶以及缓冲液可以为本领域常规DNA聚合酶和缓冲液，其用量具体的可以参照产品说明书中的详细说明。本专利技术在此不再详细赘述。在本专利技术中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，优选地，PCR扩增过程包括28-33个循环，单个循环包括变性、退火和延伸的步骤。所述循环反应中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式及退火参数，在本专利技术中，为了得到更好的扩增效果，退火温度为55-65℃，退火时间为25-40s。所述循环反应中的变性过程可以为本领域所常规使用的变性方式及变性参数，在本专利技术中，为了得到更好的扩增效果，变性温度为93-95℃。所述循环反应中的延伸方式及延伸参数，在本专利技术中，为了得到更好的扩增效果，延伸温度为70-73℃。另外，为了保证得到更好的扩增效果，所述扩增过程还包括首次循环前93-95℃预变性5min，退火温度58℃，最后一次循环后于71-73℃再延伸10min。本专利技术还提供了一种根据上述特异性PCR引物或上述鉴定方法在鉴定毛冠鹿(Elaphoduscephalophus)中的应用。本专利技术通过设计特异性PCR引物，利用特异性PCR扩增的方法，对待测样品通过一次常规的PCR扩增即可通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示判定出该物种是否为毛冠鹿，且所用的DNA模板可从动物的毛皮、肌肉组织、内脏中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定毛冠鹿，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定毛冠鹿的目的。其整个检测过程总共耗时不超过3个小时，且操作过程简单，具有广泛的应用前景。本专利技术涉及的引物及鉴定方法在开发成试剂盒后，可广泛应用于毛冠鹿物种的鉴定及种群检测研究中，具有较大的推广价值。本专利技术的优点将在下文的具体实施方式部分进行进一步的详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是实施例1-4和对比例1-11的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。以下将通过实施例对本专利技术进行详细描述。需要阐明的是，所述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成且引物使用浓度为10pmol/L，所述裂解液可以为本领域常规使用的DNA裂解液，例如，在本专利技术中，每升所述裂解液中含有50mmol的Tris-HCl(pH8.0)、25mmol的乙二胺四乙酸(pH8.0)、100mmol的氯化钠和1％重量份的十二烷基硫酸钠，本专利技术中使用的dNTPMix为北京全式金生物技术有限公司的市售品，蛋白酶K为美国Merck公司的市售品，所述DNA纯化试剂盒为北本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定毛冠鹿(Elaphodus cephalophus)的特异性PCR引物，其特征在于，所述特异性PCR引物包括如SEQ ID No：1所示的引物1，以及如SEQ ID No：2所示的引物2。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定毛冠鹿(Elaphoduscephalophus)的特异性PCR引物，其特征在于，所述特异性PCR引物包括如SEQIDNo：1所示的引物1，以及如SEQIDNo：2所示的引物2。2.一种利用特异性PCR引物鉴定毛冠鹿的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)采用特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述特异性PCR引物为权利要求1中所述的特异性PCR引物；其中，在步骤(3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中出现1条条带，则判断所述待测样品为来自毛冠鹿的样品，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自毛冠鹿的样品。3.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏鹏，李香凝，王美菊，李延颖，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34