【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核苷三磷酸催化合成，具体涉及一种用于催化脱氧核糖胞苷酸生成脱氧胞苷三磷酸的重组基因、重组酶及其应用。
技术介绍
1、核苷三磷酸(ntps)包括胞苷三磷酸(ctp)、腺苷三磷酸(atp)、鸟苷三磷酸(gtp)和尿苷三磷酸(utp)。ntps在生物细胞中扮演着重要角色，它们不仅是核糖核酸合成的重要前体，同时也是重要的能量物质，其在能量的转移、贮存、磷酸化等机体代谢过程中必不可少。
2、脱氧核苷三磷酸(dntps)是dna合成的重要前体物质，并且为分子生物学研究的重要试剂。其中脱氧胸苷三磷酸(dttp)是多种糖类合成的重要中间产物，例如一些多聚糖的前体物质-dtdp-糖，就是由dttp合成。dntps的激酶酶法合成也已有相关报道，例如现有技术中提出了一种以dnmps为起始原料、以四个dnmp激酶和pkase作为催化激酶，生物合成四种dntp(datp、dgtp、dctp、ttp)的策略。
3、目前合成脱氧胞苷三磷酸(dctp)的方法主要是化学方法，合成过程耗能较大，而且需要有毒催化剂参与，污染环境。而生物酶法催化脱氧胞苷酸(dcmp)生成脱氧胞苷三磷酸(dctp)可以减少环境污染，符合绿色发展需求，所以，有必要开发高效的生物酶法催化脱氧胞苷酸生成脱氧胞苷三磷酸。
技术实现思路
1、专利技术目的：针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种用于催化脱氧核糖胞苷酸(dcmp)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dctp)的重组基因，该重组基因有效提高了底物dcmp生
2、本专利技术还提供用于催化脱氧胞苷酸生成脱氧胞苷三磷酸的重组酶、重组载体、重组菌及其应用。
3、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种用于催化脱氧核糖胞苷酸(dcmp)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dctp)的重组基因，所述重组基因包括冰核蛋白和cmk酶的编码基因、以及冰核蛋白和ack酶的编码基因，所述冰核蛋白和cmk酶的编码基因的碱基序列如seq id no.1所示，所述冰核蛋白和ack酶的编码基因如seq id no.3所示。
4、其中，所述cmk酶的编码基因和ack酶的编码基因来源于菌株假单胞菌lys和贪铜菌dl-d2，其碱基序列分别如seq id no.5-6所示。
5、其中，所述冰核蛋白编码基因的碱基序列如seq id no.7所示。
6、本专利技术所述的用于催化脱氧核糖胞苷酸(dcmp)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dctp)的重组基因编码的重组酶，包括所述重组基因包括冰核蛋白和cmk酶的编码基因、以及冰核蛋白和ack酶的编码基因对于的重组酶，重组酶的氨基酸序列分别如seq id no.2和4所示。
7、本专利技术所述的重组基因的表达载体的构建方法，包括如下步骤：
8、(1)培养菌株dl-d2和菌株lys，试剂盒抽提基因组；
9、(2)设计引物inpn-cmk-f/inpn-r1扩增冰核蛋白基因，获得第一inpn179片段；
10、(3)设计引物cmk-f2/inpn-cmk-r扩增菌株lys的基因组，获得片段cmk片段；
11、(4)设计引物对inpn-cmk-f/inpn-cmk-r，以第一inpn179片段和cmk片段同时为模版overlap pcr扩增获得inpn-cmk片段；
12、(5)设计引物petduet-1-f2/petduet-1-r2扩增petduet-1质粒，获得线性化载体片段petduet-1(ncoⅰ+notⅰ)；
13、(6)利用无缝克隆，无缝连接petduet-1(ncoⅰ+notⅰ)片段和inpn-cmk片段，转化到感受态细胞，涂板，培养过夜，得到petduet-1-inpn-cmk菌株，提取质粒得到质粒petduet-1-inpn-cmk；
14、(7)设计引物inpn-ack-f/inpn-r2扩增冰核蛋白基因，获得第二inpn179片段；
15、(8)设计引物ack-f2/inpn-ack-r扩增dl-d2基因组，获得片段ack片段；
16、(9)设计引物对inpn-ack-f/inpn-ack-r，以第二inpn179片段和ack片段同时为模版overlap pcr扩增获得inpn-ack片段；
17、(10)设计引物petduet-1-inpn-cmk-f/petduet-1-inpn-cmk-r扩增质粒petduet-1-inpn-cmk，获得线性化载体片段petduet-1-inpn-cmk(ndeⅰ+xhoⅰ)；
18、(11)利用无缝克隆，无缝连接petduet-1-inpn-cmk(ndeⅰ+xhoⅰ)片段和inpn-ack片段，转化到感受态细胞，涂板，培养过夜，得到petduet-1-inpn-cmk-inpn-ack菌株，提取质粒得到重组载体petduet-1-inpn-cmk-inpn-ack。
19、其中于，所述构建方法中所用引物入下所示：
20、
21、本专利技术所述重组菌，所述重组菌含所构建的重组载体。
22、其中，所述的重组菌以大肠杆菌bl21为出发菌株。
23、本专利技术所述的重组基因或者所构建的表达载体或者重组菌在催化脱氧胞苷酸(dcmp)生成脱氧胞苷三磷酸(dctp)中的应用。
24、其中，所述应用包括如下步骤：
25、(1)将含有权利要求1所述的重组基因的重组载体petduet-1-inpn-cmk-inpn-ack转化到大肠杆菌bl21感受态细胞中得到阳性重组菌株；
26、(2)将重组菌株加入底物dcmp中催化生成dctp。
27、本专利技术构建了一个全新的用于催化脱氧核糖胞苷酸(dcmp)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dctp)的重组基因，由分别来自假单胞菌lys和贪铜菌dl-d2的cmk酶的编码基因和ack酶的编码基因，与冰核蛋白编码基因组成。其中cmk的km为22.345mm，vmax为0.786mm/min；ack的km为10.008mm，vmax为0.94mm/min。含本专利技术全新的重组基因的重组载体petduet-1-inpn-cmk-inpn-ack，转化到大肠杆菌中进行全细胞催化，将50mm的脱氧核糖胞苷酸在1h内催化生成47mm左右的脱氧核糖胞苷三磷酸，产率高达95％左右，转化效率非常高。本专利技术通过特定的连接方式将特定冰核蛋白锚定序列inpn基因与cmk和ack连接，显著提升了催化脱氧核糖胞苷酸(dcmp)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dctp)效率，并且显著高于其他连接方式，同时也显著提高了重复连续催化的效率和稳定性。
28、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
29、本专利技术合成了一种全新的用于催化脱氧核糖胞苷酸生成脱氧核糖胞苷三磷酸的重组基因，其中通过特定的cmk酶和ack酶在全细胞催化中的高效表达，并本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于催化脱氧核糖胞苷酸(dCMP)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dCTP)的重组基因，其特征在于，所述重组基因包括冰核蛋白和CMK酶的编码基因、以及冰核蛋白和ACK酶的编码基因，所述冰核蛋白和CMK酶的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述冰核蛋白和ACK酶的编码基因如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述CMK酶的编码基因和ACK酶的编码基因分别来源于菌株假单胞菌Lys和菌株贪铜菌DL-D2，其碱基序列分别如SEQ ID NO.5和6所示。
3.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述冰核蛋白编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
4.一种权利要求1所述的用于催化脱氧核糖胞苷酸(dCMP)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dCTP)的重组基因编码的重组酶，其特征在于，包括所述重组基因包括冰核蛋白和CMK酶的编码基因、以及冰核蛋白和ACK酶的编码基因对于的重组酶，重组酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2和4所示。
5.一种含有权利要求1所述的重组基因的表达载体的构
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法中所用引物入优选下所示：
7.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含权利要求5所构建的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌BL21为出发菌株。
9.一种权利要求1所述的重组基因或者权利要求4所构建的表达载体或者权利要求6所述的重组菌在催化核糖脱氧胞苷酸(dCMP)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dCTP)中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种用于催化脱氧核糖胞苷酸(dcmp)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dctp)的重组基因，其特征在于，所述重组基因包括冰核蛋白和cmk酶的编码基因、以及冰核蛋白和ack酶的编码基因，所述冰核蛋白和cmk酶的编码基因的碱基序列如seq id no.1所示，所述冰核蛋白和ack酶的编码基因如seq id no.3所示。
2.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述cmk酶的编码基因和ack酶的编码基因分别来源于菌株假单胞菌lys和菌株贪铜菌dl-d2，其碱基序列分别如seq id no.5和6所示。
3.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述冰核蛋白编码基因的碱基序列如seq id no.7所示。
4.一种权利要求1所述的用于催化脱氧核糖胞苷酸(dcmp)生成脱氧核糖胞苷三磷酸(dctp)的重组基因编码的重组酶，其特征在于，包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘洪明，熊成成，尹夏业，李华兴，刘顺，王思文，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：
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