【技术实现步骤摘要】
本公开涉及细胞生物学、分子生物学和医药领域，更具体涉及基因治疗。
技术介绍
1、尽管近来针对单基因隐性遗传病的基因补充治疗取得了成功，但用以治疗显性常染色体遗传疾病的治疗方法却发展较慢。疾病等位基因的突变特异性敲低和/或敲除在很大程度上受限于rna干扰的脱靶效应和原型间隔区相邻基序(pam)位点的可用性。碱基编辑或先导编辑可以准确修复疾病等位基因，但不广泛适用于具有高突变异质性的疾病。
2、例如，显性常染色体视网膜色素变性(adrp)是一种具有高遗传异质性的常染色体显性光感受器变性疾病，具有超过90个致病基因，包括rho(20-30％adrp)、rp1(5-10％adrp)、rprh2(5％adrp)和impdh1(>2％adrp)。rho基因编码的视紫红质蛋白即是一个具体的rp致病基因。视紫红质蛋白是一种光敏性g蛋白偶联受体，能够激活视网膜中杆状光感受细胞中的光转导。rho突变占所有adrp的20-30％，并且已鉴定了超过200种功能丧失性和功能获得性rho基因突变，其中rhop23h(p.pro23his，c.68c>a)突变是adrp患者中最常见的突变。1-3尽管基因补充治疗已成为一种有前景的隐性常染色体遗传rp(arrp)治疗方法，但由于对突变等位基因的破坏效率低以及存在大量尚未解决的功能丧失性和功能获得性突变，治疗常染色体显性rp(adrp)仍然面临挑战。
3、存在对用于治疗显性常染色体遗传病症的改进方法和组合物的需求。
技术实现思路
2、在一些方面，本文提供了用于编辑细胞基因组的方法，该方法包括使细胞与包含核酸酶和编码敲入盒的外源核酸的组合物接触，所述敲入盒包含野生型基因的编码序列以及用于野生型基因表达的翻译起始和终止元件，其中核酸酶使编码野生型基因的突变变体的内源核酸在5’utr内产生断裂，其中内源核酸在5’至3’方向上编码5’utr、用于野生型基因突变变体表达的翻译起始元件以及野生型基因的突变变体的编码序列，其中编码敲入盒的外源核酸通过非同源依赖性靶向整合而被整合至由内源核酸编码的翻译起始元件上游(5’)的内源核酸的5’utr中。
3、在一些方面，本文还提供了组合物，其包含：核酸酶；编码敲入盒的外源核酸，所述敲入盒包含野生型基因的编码序列以及用于表达野生型基因的翻译起始和终止元件；其中，当引入细胞中时，核酸酶引起编码野生型基因的突变变体的内源核酸的5’utr内的断裂，其中内源核酸在5’至3’方向编码5’utr、用于表达野生型基因突变变体的翻译起始元件、以及野生型基因的突变变体的编码序列，并且其中编码敲入盒的外源核酸通过不依赖于同源性的靶向整合被整合至由内源核酸编码的翻译起始元件上游(5’)的内源核酸的5’utr中。
4、在一些方面，本文还提供了包含基因组修饰的工程化细胞，其中所述基因组修饰包括编码敲入盒的外源核酸在细胞的基因组中的整合，其中所述敲入盒包含野生型基因的编码序列，并且其中编码敲入盒的外源核酸被整合至编码野生型基因突变变体的内源核酸的5’utr中，其中所述内源核酸在5’至3’方向上编码5’utr、用于表达野生型基因突变变体的翻译起始元件、以及野生型基因突变变体的编码序列，并且其中编码敲入盒的外源核酸通过不依赖于同源性的靶向整合被整合至由内源核酸编码的翻译起始元件上游(5’)的内源核酸的5’utr中。
5、在一些方面，本文还提供了用于治疗或预防被鉴定为表达突变基因的受试者中的常染色体遗传病症的方法，所述方法包括向受试者的细胞中引入有效量的组合物，该组合物包含：核酸酶；编码敲入盒的外源核酸，所述敲入盒包含野生型基因的编码序列以及用于表达野生型基因的翻译起始和终止元件；其中核酸酶引起编码突变基因变体的内源核酸的5’utr内的断裂，其中内源核酸在5’至3’方向上编码5’utr、用于表达突变基因变体的翻译起始元件、以及突变基因变体的编码序列，其中编码敲入盒的核酸通过不依赖于同源性的靶向整合被整合至由内源核酸编码的翻译起始元件上游(5’)的内源核酸的5’utr中，并且其中编码敲入盒的核酸的整合导致野生型基因的表达，并且其中野生型基因的表达导致突变基因变体的表达减少。
6、在一些方面，本文还提供了组合物，其包含：cas9核酸酶；编码敲入盒的外源核酸，所述敲入盒包含野生型基因的编码序列和用于表达野生型基因的翻译起始和终止元件；以及crispr/cas核酸酶的引导分子，以将cas9引导至编码野生型基因突变变体的内源核酸的5’utr，其中所述内源核酸在5’至3’方向上编码5’utr、用于表达野生型基因突变变体的翻译起始元件、以及野生型基因突变变体的编码序列，并且其中，当引入细胞中时，核酸酶引起编码野生型基因突变变体的内源核酸的5’utr内的断裂，并且其中编码敲入盒的外源核酸通过不依赖于同源性的靶向整合被整合至由内源核酸编码的翻译起始元件上游(5’)的内源核酸的5’utr中。
7、在本文公开的组合物和方法中，编码敲入盒的外源核酸不必须与编码野生型基因突变变体的内源核酸框内整合，即外源核酸的编码框可以与內源核损的编码框一致或者也可以不一致。
8、在本文公开的组合物和方法中，敲入盒的侧翼可以具有同源臂或者没有同源臂，从而外源核酸的敲入可以基于同源介导修复(homologous directed repair，hdr)进行，或者可以基于不依赖于同源性的靶向整合(hiti)进行。
9、在一些方面，编码敲入盒的外源核酸的整合导致细胞表达野生型基因。在一些方面，细胞对所敲入的野生型基因的表达抑制了野生型基因的突变变体的表达。
10、在本文公开的组合物和方法的一些方面，核酸酶是crispr/cas核酸酶，并且所述方法还包括使细胞与用于crispr/cas核酸酶的引导分子接触。在一些方面，核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应物核酸酶(talen)或大范围核酸酶。
11、在本文公开的组合物和方法的一些方面，核酸酶由编码敲入盒的同一外源核酸编码，并且其中外源核酸包含在载体中。在一些方面，核酸酶是crispr/cas核酸酶，并且其中包含编码核酸酶和敲入盒的外源核酸的载体进一步包含编码用于crispr/cas核酸酶的引导分子的核酸。在一些方面，载体是质粒、转座子、粘粒、人工染色体、脂质纳米颗粒或病毒载体。在一些方面，载体是病毒载体，并且其中病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。在特定的方面，病毒载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于体外编辑细胞基因组的方法，所述方法包括使所述细胞与包含核酸酶和编码敲入盒的外源核酸的组合物接触，所述敲入盒包含野生型基因的编码序列以及用于表达所述野生型基因的翻译起始和终止元件，
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码敲入盒的外源核酸的整合导致所述细胞表达所述野生型基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞对所述野生型基因的表达抑制了所述野生型基因突变变体的表达。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是CRISPR/Cas核酸酶，并且其中所述方法进一步包括使所述细胞与用于所述CRISPR/Cas核酸酶的引导分子接触。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述核酸酶由编码所述敲入盒的同一外源核酸编码，并且其中所述外源核酸包含在载体中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶是CRISPR/Cas核酸酶，并且其中包含编码
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述载体是质粒、转座子、粘粒、人工染色体、脂质纳米颗粒或病毒载体。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体，并且其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
...【技术特征摘要】
1.一种用于体外编辑细胞基因组的方法，所述方法包括使所述细胞与包含核酸酶和编码敲入盒的外源核酸的组合物接触，所述敲入盒包含野生型基因的编码序列以及用于表达所述野生型基因的翻译起始和终止元件，
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码敲入盒的外源核酸的整合导致所述细胞表达所述野生型基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞对所述野生型基因的表达抑制了所述野生型基因突变变体的表达。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是crispr/cas核酸酶，并且其中所述方法进一步包括使所述细胞与用于所述crispr/cas核酸酶的引导分子接触。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应物核酸酶(tale...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。