【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种或多种用于无创胚胎植入前基因检测的准确方法。具体地，本专利技术涉及用于扩增溶液中的微量dna的系统和方法，以及分析来自体外培养胚胎的培养液中的生物样本以确定胚胎中遗传病的易感性的连锁分析方法。
技术介绍
1、如本领域已知的胚胎植入前基因检测(pgt)(handyside等人，1989和1990，针对第一胎出生)已被广泛用于临床体外授精(ivf)以避免选择患有单基因病(monogenic disease)(kerem等人，1989；handyside等人，1992；liu等人，1994；harton等人，1996；ao等人，1998；sermon等人，1998；xu等人，1999；hussey等人，1999；ray等人，2000；de rycke等人，2001；moutou等人，2001；verlinsky等人，2001；sermon等人，2001；girardet等人，2003；fiorentino等人，2006；kahraman等人，2014)、非整倍体(munné等人，1993；wilton等人，2001；wells等人，2002；treff等人，2010；gutiérrez-mateo等人，2011；yang等人，2012；scott等人，2013；forman等人，2013；wells等人，2014；rubio等人，2017)、结构变异(conn等人，1998；scriven等人，1998；coonen等人，2000；munné等人，2000；escudero等人，2003；melotte等人，2004
2、使用囊胚腔液(bf)中的游离dna进行扩增和基因检测被报道为微创胚胎植入前基因检测(palini 2013；gianaroli等人，2014；tobler等人，2015；magli等人，2016；zhang等人，2016；shangguan等人，2017；capalbo等人，2018；tsuiko等人，2018；magli等人，2018)。
3、本专利技术描述了一种使用废弃的胚胎培养液中的游离dna来对非整倍体和单基因病的完全无创的胚胎植入前基因检测方式(galluzzi等人，2015；wu等人，2015；xu等人，2016；shamonki等人，2016；feichtinger等人，2017；lane等人，2017；liu等人，2017；ho等人，2018；vera-rodriguez等人，2018；capalbo等人，2018；fang等人，2019；huang等人，2019；rubio等人，2019；yeung等人，2019；jiao等人，2019；ou等人，2022)。
4、微创胚胎植入前基因检测和无创胚胎植入前基因检测是避免胚胎植入前基因检测技术中的活检损伤的两种主要方法。胚胎培养方法和废培养液(scm)收集方法，以及用于微量游离dna的单细胞全基因组扩增(scwga)方法，可以直接影响结果。来自囊胚腔液(bf)和废弃的胚胎培养液的样本的扩增成功率在不同的临床中心有很大差异。当使用相同的扩增方法时，bf中的扩增成功率远低于废培养液(scm)中的扩增成功率，如galluzzi等人(2015)报道的62.5％ scm vs 44.4％ bf，capalbo等人(2018)报道的89.7％ scm vs27.4％ bf。虽然scm的扩增成功率高于bf，但scm的结果受到母源污染以及胚胎发育培养液中外源蛋白的添加的影响。研究表明，母体血中的母体dna片段比胎儿dna片段更长(chan等人，2004)，并且扩增技术对片段长度的偏倚使得其对胎儿dna扩增低效。此外，在维持临床检测用途的产量的同时，确保扩增的准确度也很重要。目前，可用的商业单细胞扩增试剂盒基于dop-pcr、mda或malbac技术，并且这些商业试剂盒在扩增效率和保真度方面有差异(huang等人，2015)。这些方法都是指数式扩增，会引起较高的假阴性和假阳性。在2017年，专利技术了一种新型扩增方法，即线性扩增(chen等人，2017，us10,894,980，称为“lianti”)。snp检测的假阳性率远低于其它方法。然而，这些试剂盒并未针对培养液中所含的dna片段长度特征和高蛋白质含量进行改善，而只是扩大了反应体系，导致培养液的扩增效率不高。迫切需要一种高效且准确的扩增方法以在scm或/和bf系统中获得更多胚胎dna信息。然而，原始lianti方法的产量太低，并且可重复性较低，由于胚胎较珍贵，因此并不适合临床应用。
5、就分析而言，存在许多关于非整倍体的无创胚胎植入前基因检测(nipgt-a)的报道(leaver等人，2020中综述)，但仅有几篇关于无创胚胎植入前单基因疾病基因检测(nipgt-m)的报告(galluzzi等人，2015；zhang等人，2016；shangguan等人，2018；wu等人，2015；liu等人，2017；capalbo等人，2018；ou等人，2022)。在用scm进行nipgt-m检测的报道中，与滋养外胚层活检结果相比，成功扩增的scm中的基因型一致性也有很大差异，从21％到88％不等(capalbo等人，2018；liu等人，2017；ou等人，2022)。这些论文中并未提及假阳性和假阴性率这些评估检测方法准确度的重要指标。然而，基于文献报道的基因型一致率，可以判断其假阴性和假阳性率非常高，这些结果对无创pgt-m在临床上应用是不利的(capalbo等人，2018；cimadomo等人，2020)。pgt-m评估的最重要标准不是基因型一致率，而是误诊率。eshre pgt联盟公布的误诊率非常低(<0.1％)(de rycke等人，2017)。应当对新型检测方法的误诊风险进行评估，并与传统pgt-m进行比较。
6、除了检测疾病相关突变位点之外，已报道的论文中使用的分析方法是连锁分析方法。在等位基因脱扣(allele drop-out，ado)率低于5％时，建议应用突变位点上下游的至少各两个有效信息str标记或snp位点(欧洲人类生殖和胚胎学协会(eshre)2020)。ou等人使用了4个含有有效信息的snp位点，liu等人使用了10个有效snp位点。由于scm或bf的ado本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于对溶液中的DNA进行扩增的方法，其中所述溶液中的DNA含量最低可为皮克水平，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液是培养液或囊胚腔液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA引物具有15bp至20bp的长度。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA引物的3’端含有5'-GACAG-3或5'-CTGTC-3'序列，优选地所述DNA引物含有如5'-AGATGTG TATAAGAGACAG-3'(Seq.ID No.:1)或5'-TCTACACATATTCTCTGTC-3'(Seq.ID No.:2)所示的序列，或者与Seq.ID No.:1或Seq.IDNo.:2有至少70％，优选地80％，优选地90％，优选地95％，优选地100％的相同性。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲液是2x至10x裂解缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解混合物中的所述蛋白酶的工作浓度高于0.6mg/mL，优选地在0.8-2mg/mL的范围内。
7.根据权利
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述灭活在80-90℃下执行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述转座体的工作浓度高于6nM，优选地在10-40nM的范围内。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述循环扩增执行超过4个循环，如4至20个循环，优选地6至15个循环。
11.一种用于对培养液中的DNA进行扩增的方法，其中所述培养液中的DNA含量最低可为皮克水平，所述方法包括以下步骤：
12.一种分析体外培养胚胎的培养液中的生物样本以确定所述胚胎中遗传病的易感性的方法，其包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述胚胎具有由母体细胞和/或单倍型丢失所致的污染。
14.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤3)中，定位和SNP调用输出了所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的各个SNP的物理位置、等位基因类型、等位基因深度以及测序质量。
15.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤3)中，控制所述SNP数据的质量经由过滤掉所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的基因质量(GQ)值较低的SNP来执行。
16.根据权利要求15所述的方法，其中过滤掉所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的最低20％GQ值的SNP。
17.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤3)中，估计邻近所述致病突变位点的区域中SNP的测序误差率和相对密度，并且排除SNP密度极低或测序误差率高的所述培养液的样本。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述排除的SNP密度小于0.001，或者所述排除的测序误差率大于0.2。
19.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤4)中，采用所述家系中以下样本中的任一种或多种：先症者的血液样本、废弃胚胎的生物样本，或至少一位祖父母的血液样本。
20.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤5)中，当计算每个单独SNP的似然率时，要结合所述估计的测序误差率。
21.根据权利要求12所述的方法，其中步骤6)还包括以下步骤：
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤b)使用标签搜索法。
23.根据权利要求21所述的方法，其中在步骤a)之后，排除具有异常MCC率的样本。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述异常MCC率大于0.65或小于-0.5。
25.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤7)中使用贝叶斯模型和递归算法。
26.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤8)中，首先绘制所述致病突变位点的上游和下游区域两者的对数似然曲线。
27.根据权利要求12所述的方法，其中所述遗传病包括单基因病和多基因病。
28.根据权利要求12至27中任一项所述的方法，其中在步骤8)之后，将所述胚胎的多个所鉴定的SNP组合以确定其对多基因病的易感性。
29.一种分析体外培养胚胎的培养液中的生物样本以确定所述胚胎中遗传病的易感性的方法，其包括：
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述胚胎具有由母体细胞和/或单倍型丢失所致的污染。
31.根据权利要求29所述的方法，其...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于对溶液中的dna进行扩增的方法，其中所述溶液中的dna含量最低可为皮克水平，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液是培养液或囊胚腔液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna引物具有15bp至20bp的长度。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述dna引物的3’端含有5'-gacag-3或5'-ctgtc-3'序列，优选地所述dna引物含有如5'-agatgtg tataagagacag-3'(seq.id no.:1)或5'-tctacacatattctctgtc-3'(seq.id no.:2)所示的序列，或者与seq.id no.:1或seq.idno.:2有至少70％，优选地80％，优选地90％，优选地95％，优选地100％的相同性。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲液是2x至10x裂解缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解混合物中的所述蛋白酶的工作浓度高于0.6mg/ml，优选地在0.8-2mg/ml的范围内。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育在45-60℃下执行1至3小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述灭活在80-90℃下执行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述转座体的工作浓度高于6nm，优选地在10-40nm的范围内。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述循环扩增执行超过4个循环，如4至20个循环，优选地6至15个循环。
11.一种用于对培养液中的dna进行扩增的方法，其中所述培养液中的dna含量最低可为皮克水平，所述方法包括以下步骤：
12.一种分析体外培养胚胎的培养液中的生物样本以确定所述胚胎中遗传病的易感性的方法，其包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述胚胎具有由母体细胞和/或单倍型丢失所致的污染。
14.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤3)中，定位和snp调用输出了所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的各个snp的物理位置、等位基因类型、等位基因深度以及测序质量。
15.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤3)中，控制所述snp数据的质量经由过滤掉所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的基因质量(gq)值较低的snp来执行。
16.根据权利要求15所述的方法，其中过滤掉所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的最低20％gq值的snp。
17.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤3)中，估计邻近所述致病突变位点的区域中snp的测序误差率和相对密度，并且排除snp密度极低或测序误差率高的所述培养液的样本。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述排除的snp密度小于0.001，或者所述排除的测序误差率大于0.2。
19.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤4)中，采用所述家系中以下样本中的任一种或多种：先症者的血液样本、废弃胚胎的生物样本，或至少一位祖父母的血液样本。
20.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤5)中，当计算每个单独snp的似然率时，要结合所述估计的测序误差率。
21.根据权利要求12所述的方法，其中步骤6)还包括以下步骤：
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤b)使用标签搜索法。
23.根据权利要求21所述的方法，其中在步骤a)之后，排除具有异常mcc率的样本。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述异常mcc率大于0.65或小于-0.5。
25.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤7)中使用贝叶斯模型和递归算法。
26.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤8)中，首先绘制所述致病突变位点的上游和下游区域两者的对数似然曲线。
27.根据权利要求12所述的方法，其中所述遗传病包括单基因病和多基因病。
28.根据权利要求12至27中任一项所述的方法，其中在步骤8)之后，将所述胚胎的多个所鉴定的snp组合以确定其对多基因病的易感性。
29.一种分析体外培养胚胎的培养液中的生物样本以确定所述胚胎中遗传病的易感性的方法，其包括：
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述胚胎具有由母体细胞和/或单倍型丢失所致的污染。
31.根据权利要求29所述的方法，其中在步骤3)中，定位和snp调用输出了所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的各个snp的物理位置、等位基因类型、等位基因深度以及测序质量。
32.根据权利要求29所述的方法，其中在步骤3)中，控制所述snp数据的质量经由过滤掉所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的基因质量(gq)值较低的snp来执行。
33.根据权利要求32所述的方法，其中过滤掉所述体外培养胚胎的所述培养液中的所述生物样本和/或所述家系中所述废弃胚胎的所述生物样本的最低20％gq值的snp。
34.根据权利要求29所述的方法，其中在步骤3)中，估计邻近所述致病突变位点的所述区域中snp的测序误差率和相对密度，并且排除snp密度极低或测序误差率高的所述培养液的样本。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述排除的snp密度小于0.001，或者所述排除的测序误差率大于0.2。
36.根据权利要求29所述的方法，其中在步骤4)中，采用所述家系中以下样本中的任一种或多种：先症者的血液样本、废弃胚胎的生物样本，或至少一位祖父母的血液样本。
37.根据权利要求29所述的方法，其中在步骤5)中，当计算每个单独snp的似然率时，要结合所述估计的测序误差率。
38.根据权利要求29所述的方法，其中步骤6)还包括以下步骤：
39.根据权利要求38所述的方法，其中步骤b)使用标签搜索法。
40.根据权利要求38所述的方法，其中在步骤a)之后，排除具有异常mcc率的样本。
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄蕾，葛颢，张锐麒，谢晓亮，
申请(专利权)人：北京昌平实验室，
类型：发明
国别省市：
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