团头鲂转铁蛋白基因SNP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于鱼类分子标记筛选技术领域，具体涉及团头鲂转铁蛋白基因SNP分子标记及应用。所述的分子标记由团头鲂转铁蛋白基因中克隆得到，其中分子标记1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的128位碱基处存在一个等位基因突变(A/G)，(该突变位于转铁蛋白基因内含子部分)。本发明专利技术的另一个分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，在该序列的169位碱基处存在一个等位基因突变(C/A)，该突变导致ScaI酶酶切多态性。利用本发明专利技术筛选的两个分子标记对团头鲂抗病性状进行了关联分析，本发明专利技术为团头鲂抗病性状辅助选择提供了新的遗传资源。

Molecular megalobramaamblycephala transferrin gene SNP markers and its application

The invention belongs to the technical field of fish molecular marker screening, in particular to the transferrin gene SNP molecular marker megalobramaamblycephala and application. Molecular marker which is composed of a bream transferrin gene was cloned, including 1 molecular markers of nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 shows, the existence of a mutant allele in the 128 base of the sequence (A/G), (the mutation is located in transferrin gene intron part). Another molecular marker of the invention of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2 shows, the existence of a mutant allele in the 169 base of the sequence (C/A), the ScaI mutation enzyme polymorphism. The Wuchang bream disease resistance traits correlation analysis was conducted using two molecular markers screened by the invention, the invention provides new genetic resources for megalobramaamblycephala disease resistance traits assisted selection.

【技术实现步骤摘要】
团头鲂转铁蛋白基因SNP分子标记及其应用
本专利技术属于鱼类分子标记制备领域，具体涉及团头鲂转铁蛋白基因SNP分子标记及应用，所述的分子标记可应用于辅助团头鲂抗病品种的选育。
技术介绍
团头鲂(Megalobramaamblycephala)又名武昌鱼，属鲤形目，鲤科，鲌亚科，鲂属，是我国重要的经济养殖鱼类。近年来人们对团头鲂需求量的提升使得养殖规模进一步扩大，已成为我国主要的经济养殖鱼类之一。但在大规模养殖的过程中，由于近亲繁殖、养殖密度高、水质恶化等导致疾病爆发频繁，其中，细菌性败血症是危害最大的疾病之一。在推广生态养殖、改善养殖环境的同时，深入分析鱼类的免疫应答机制、研究抗病相关基因、选育获得抗病品种成为不可阻挡的趋势。鱼类是兼具特异性免疫与非特异性免疫的低等脊椎动物，与哺乳类相比，鱼类的特异免疫系统尚不发达，特异性免疫机制还不完善，非特异性免疫在抵御外界刺激及外源微生物中发挥重要作用。铁稳态对生命活动至关重要，铁代谢是通过一系列基因表达产物(蛋白)协调，主要是在肝脏中完成。这些蛋白主要通过结合和转运铁来完成调控过程，其中，转铁蛋白(Transferrin，TF)是重要的铁结合和转运蛋白。转铁蛋白主要存在于脊椎动物细胞外液和血浆中，转铁蛋白既有结合、运输铁的功能，又在抵抗细菌入侵的过程中发挥重要作用。转铁蛋白通过从病原菌隔绝铁元素起到营养免疫的作用，在病原菌入侵时，与宿主争夺铁离子，转铁蛋白与铁离子紧密结合，防止铁离子被细菌掠夺。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指基因水平上单个核苷酸发生变异(单碱基插入、缺失、转换、颠换)所引起的DNA序列多态性，一般表现为二态的遗传变异，即在该位点仅存在两种不同碱基。SNP在人类基因组中分布广泛，平均500～1000个碱基对中就存在一个，占所有已知多态性的90％以上。SNP分布广泛、密度高、数量多、易于自动化分析，是继限制性片段长度多态性和微卫星多态性后的第三代DNA遗传标记。SNP技术在构建高密度遗传连锁图谱、连锁不平衡分析和关联性分析、种群进化和亲缘关系的研究中有很广阔的应用前景。在构建高密度遗传连锁图谱时，SNPs成为微卫星标记后应用最广的作图标记。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供团头鲂转铁蛋白基因的SNP分子标记，用于团头鲂抗病品种的选育。本专利技术通过给团头鲂注射嗜水气单孢菌进行攻毒，采用引物设计、PCR扩增测序、SNP位点筛选获得SNP位点，通过高分辨率熔解曲线法和限制性内切酶酶切法对SNP位点进行分析，用SPSS软件对数据进行处理，通过卡方检验分析不同基因型与抗病性状的显著性差异。在转铁蛋白基因中发现2个与团头鲂抗病性状显著相关的SNPs位点，这两个SNPs位点分别为：序列1中128位A突变为G(1-128A/G)，序列2中169位A突变为C(2-169A/C)。申请人通过基因克隆技术，采用高分辨率溶解曲线法及限制性内切酶酶切法，首次证实2个与团头鲂抗病相关基因转铁蛋白基因(GI:633265707)多态性SNP分子标记。128碱基位A/G位点采用高分辨率溶解曲线法制备，2-169A/C位点采用限制性内切酶酶切法制备。申请人筛选到一个与团头鲂抗病性状相关的基因即转铁蛋白基因SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：tcttctgcccatatatatttaccttttttatatttctctgcaatgataggacggagtccgtaaggatgtagtccacctaagtaaatatcttttccatctgcagttacagcatctgcctcaccattctR(A/G)tgaattaaagacaatttgatgaaaatactatagtttctactgaacaaaacaagggtgagtgaggtaaaataataagcatgttttattacctggatgctcttcatgcactcagttatagaaggtcggagatgacactcaagatctgctgattt，该序列的128位碱基处的R是A或G的突变(该突变位于基因内含子部分)。申请人筛选到另一个与团头鲂抗病性状相关的基因即转铁蛋白基因SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：gtattttgcaaaactggaagtacgtaatacttgcctccaccattgggacagctttctgcatggaaggagagaatacaattttaggtttcatcaaatgtaaattctgactaataggtggcttatgaactgattcataaaatatgaggtagggtttattcttacgttgatR(A/C)gtactgctcaaccatgactggaactagaccgcactttccaccaatatatacctggccaccatcaactgcaaggcatctgcttctccacgctttggtgcaaataaaacagaatattaacctacaggtggacagtacataaagatgactgac，该序列的169位碱基处的R是A或C(该突变位点位于基因的外显子部分)，该突变导致ScaI酶切多态性。这两个分子标记可以单独使用且使用时无先后顺序。申请人设计了一种检测转铁蛋白基因SNP分子标记的引物对(该引物对也是如表4所述的用于转铁蛋白基因基因型分型的引物对的序列)，该引物对的序列如下所示：正向引物F：TTACAGCATCTGCCTCACCATTC，反向引物R：CTTGAGTGTCATCTCCGACCTTCT。本专利技术筛选的团头鲂转铁蛋白基因SNP分子标记可在团头鲂抗病性状辅助选择中的应用。附图说明序列表SEQIDNO：1是一个用于检测128位A/G位点的团头鲂转铁蛋白基因序列(即，与团头鲂抗病性状相关的分子标记1，该序列的128位碱基处的碱基是突变后的碱基G)。在该序列的128位碱基处存在一个等位基因突变，即由A突变为G。序列表SEQIDNO：2是本专利技术筛选的另一个用于检测169位A/C位点的团头鲂转铁蛋白基因序列(即，与团头鲂抗病性状相关的分子标记2，该序列的169位碱基处的碱基是突变后的碱基C)。在该序列的169位碱基处存在一个等位基因突变，即由A突变为C。序列表SEQIDNO：3是检测本专利技术的分子标记的引物对的正向引物序列。序列表SEQIDNO：4是检测本专利技术分子标记的引物对的反向引物序列。序列表SEQIDNO：5是本专利技术设计的用于模板扩增的引物序列(正向引物TF-s-a-F)。序列表SEQIDNO：6是本专利技术设计的用于模板扩增的引物序列(反向引物TF-s-a-R)。序列表SEQIDNO：7是本专利技术设计的用于模板扩增的引物序列(正向引物TF-s-b-F)。序列表SEQIDNO：8是本专利技术设计的用于模板扩增的引物序列(反向引物TF-s-b-R)。图1：利用DNA提取凝胶电泳检测图。图2：团头鲂转铁蛋白基因128碱基位A/G位点不同基因型的测序峰图。图3：团头鲂转铁蛋白基因169碱基位A/C位点不同基因型的测序峰图。图4：采用高利用分辨率熔解曲线法对转铁蛋白基因128碱基位A/G位点进行分型的结果统计图。图5：利用酶切法对转铁蛋白基因169碱基位A/C位点进行分型的凝胶电泳检测图。附图标记说明：图5中的A图是AA/AC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：tcttctgcccatatatatttaccttttttatatttctctgcaatgataggacggagtccgtaaggatgtagtccacctaagtaaatatcttttccatctgcagttacagcatctgcctcaccattctR(A/G)tgaattaaagacaatttgatgaaaatactatagtttctactgaacaaaacaagggtgagtgaggtaaaataa taagcatgtt ttattacctg gatgctcttc atgcactcag ttatagaagg tcggagatga cactcaagat ctgctgattt，上述序列的128位碱基处的R是A或G的突变。

【技术特征摘要】
1.一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：tcttctgcccatatatatttaccttttttatatttctctgcaatgataggacggagtccgtaaggatgtagtccacctaagtaaatatcttttccatctgcagttacagcatctgcctcaccattctR(A/G)tgaattaaagacaatttgatgaaaatactatagtttctactgaacaaaacaagggtgagtgaggtaaaataataagcatgttttattacctggatgctcttcatgcactcagttatagaaggtcggagatgacactcaagatctgctgattt，上述序列的128位碱基处的R是A或G的突变。2.一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：gtattttgcaaaactggaagtacgtaatacttgcctccaccattgggacagctttctgcatggaaggagagaa...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红，胡晓坤，丁祝进，崔蕾，王焕岭，王卫民，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42