本发明专利技术提供了检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物序列为：5’-CCCGCTACTTGACCACCTT-3’；下游引物序列为：5’-TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3’。本发明专利技术还提供相应的检测试剂盒。本发明专利技术实现了简便快捷的检测LF基因转录水平的目的，可以监测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）、不同组织、不同时期的LF基因的mRNA表达状态。本发明专利技术在检测LF基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及检测牛LF基因 mRNA表达水平的特异性 引物和荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)是DNA体外操作技术中最 常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异性引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放 在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA 片段在反应液中呈2n倍扩增(其中η为热循环次数)。 荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上，结合了实时荧光检测技术和计算 机分析技术。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每 个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个 样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数）； 同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2 (或10)倍稀释的已知数量的靶标DNA，获得 其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和 各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。 虽然Northern blot技术可检测基因的mRNA表达水平，但整个实验过程操作比较 复杂。Northern blot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以Northern Blot中 所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。另外，Northern Blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验 虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但 是其灵敏度较低。 而SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其 荧光大大增强。该性质用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为 497 nm，发射波长最大约为520 nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧 光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结 合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于 一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYB Green的灵敏度很高。但是，由于SYRB Green与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引 起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产 物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果。 乳铁蛋白（Lactoferrin，LF)是在分离乳清蛋白时得到的一种重要的非血红素铁 结合糖蛋白，是中性粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白，主要由乳腺上皮细胞表达 和分泌。LF蛋白具有广谱抗菌能力的单体糖蛋白，在初乳中的含量是常乳的十几倍甚至几 十倍，对幼畜初期免疫具有重要作用。LF蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗病 毒、抗氧化、抑杀肿瘤细胞、调节免疫系统等强大生物功能，不易产生耐药性，对动物的细胞 几乎没有毒性，并且不含稀有氨基酸和外源化学成分，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和 极具开发潜力的食品和饲料添加剂。在干乳期和患有乳房炎的时期，牛的乳腺中LF蛋白表 达量会显著升高，这主要是为了对抗乳腺组织中的病原微生物和炎症反应。因此，通过对LF 基因表达量的检测，可以监测牛在患病过程中免疫能力的变化。
技术实现思路
本专利技术提供了检测乳铁蛋白（Lactoferrin，LF)基因 mRNA表达水平的特异性引物 和荧光定量PCR检测试剂盒。通过大量的实验研宄，我们优化出了一套能够有效检测不同 牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛）LF基因 mRNA表达量的引物和PCR反应的条件，并组装成LF 基因 mRNA表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、动物医学和动物科 学研宄者的检测需要。 本专利技术提供一种检测牛LF基因 mRNA表达水平的特异性引物，所述特异性引物的 核苷酸序列为： 上游引物序列为：5' -CCCGCTACTTGACCACCTT-3' ； 下游引物序列为：5' -TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3'。 本专利技术的第二个目的是提供一种牛LF基因 mRNA表达水平的荧光定量PCR检测试 剂盒，所述试剂盒包括特异性引物，所述特异性引物序列为： 上游引物序列为：5' -CCCGCTACTTGACCACCTT-3' ； 下游引物序列为：5' -TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3'。 优选地，所述试剂盒还包括SYBR Green染料。 优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。 优选地，所述阳性对照的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 3。 本专利技术的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，是以待测cDNA为模板，利用 权利要求1所述的特异性引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并以 LF标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和Ct值进行定量测定。 优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件是：95°C预变性30秒；95°C 5秒， 57. 9°C 20秒，捕捉焚光信号，循环40次。 本专利技术的第四个目的是提供一种牛LF基因 mRNA表达水平的定量检测方法，是以 待测cDNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和SYBR Green染料进行实时荧光定 量PCR，记录Ct值，并以LF标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和Ct值进 行定量测定。 优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件是：95°C预变性30秒；95°C 5秒， 57. 9°C 20秒，捕捉焚光信号，循环40次。 本专利技术的第五个目的是提供权利要求1所述的特异性引物、权利要求2-5任一所 述的试剂盒、序列表中SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列在定量检测牛LF基因 mRNA表达水 平中的应用；优选地，所述牛为黄牛、奶牛和牦牛。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于： 1.本专利技术实现了简便快捷的定量检测LF基因 mRNA表达水平的目的，可以监测不同牛 种(包括奶牛、黄牛和牦牛)、不同组织、不同时期的LF基因的mRNA表达状态。 2.本专利技术在检测基因 mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的 优点。 3.本专利技术可以监测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)乳铁蛋白（Lactoferrin，LF) 基因 mRNA转录水平，通过对该基因的研宄，可以鉴定该基因与动物免疫能力的相关性。【附图说明】 附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实 施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中： 图1为LF基因 mRNA表达水平的荧光检测结果图。其中，A :扩增曲线，横坐标为PCR循 环次数，纵坐标为相对焚光量值（Re本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物序列为：5’‑CCCGCTACTTGACCACCTT‑3’；下游引物序列为：5’‑TCCACTGCTGGCACTTCTTC‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：裴杰，阎萍，郭宪，包鹏甲，褚敏，丁学智，冯瑞林，梁春年，朱新书，王宏博，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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