本发明专利技术属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域。本发明专利技术主要结合快速PCR和荧光检测方法开发了一种快速检测金银花的试剂盒，能够在较短时间内快速鉴定金银花，具有成本低、适用性好等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种快速检测金银花的试剂盒，进一步涉及使用快速检测金银花的试 剂盒快速检测金银花的方法。
技术介绍
忍冬作为药材金银花唯一的植物来源，被2010版《中国药典》收载。目前市场上 常见的金银花混淆品主要是其同属近缘种，由于它们在外观形态上十分相似，且具有相似 的化学成分，因此利用传统性状鉴别、理化鉴别手段难以将忍冬及其近缘种分开。准确、 快速是中药分子鉴别的核心需要。目前已报道的中药分子鉴别方法，如RAPD、SSR、SCAR、 PCR-RFLP、AS-PCR、AFLP及DNA条形码等均依赖于PCR技术。陈士林等公开了"一种鉴别 金银花和山银花的方法及其应用（【申请号】201210372344. 6)"，主要采用的是DNA条形码技 术；朱云国等公开了"一种鉴别金银花和山银花的PCR-RFLP方法"、黄璐琦等公开了一种基 于SNP基因分型技术的金银花药材真伪鉴别方法（申请号201210063940. 6)均采用的传统 PCR技术，以上这些方法所需要检测时间约4小时至数天不等，不利于药材的快速鉴定。本 专利技术主要结合快速PCR和荧光检测方法开发一种快速检测金银花的试剂盒，在较短时间内 快速鉴定金银花，成本低、适用性好。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专 利申请中所提及的试剂盒及监测方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速检测金银花的试剂盒，进一步涉及使用快速检测金银花的 试剂盒快速检测金银花的方法，该方法操作简单、样品量少、能快速准确的鉴定金银花药 材、粉末制剂以及活体材料，特别适用于鉴定因加工而导致DNA含量极少、形态破碎的中药 真伪的鉴定。 一种快速检测金银花药材的试剂盒，包括： 1.聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂A，B和反应引物试剂C，D，E，F， 试剂A中含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为 2. 0-5. 0 μ L、0. 5-2. 5 个单位和 10-35 μ L ; 试剂B中含有dNTP，含量为10-200 μ M ; 试剂C和D为通用引物，含量分别为0. 1-1 μΜ，其序列为： C :5' -TTATCCTTTTTTTGTTAGCGGTTTC-3' D :5' -CTCAGATCTATTTGTAAAGAAGTAAGGTGG-3' 试剂E和F为金银花引物，含量分别为0. 1-1 μΜ，其序列为： E :5, -CGAAATCGGTAGACGCTACG-3' F. 5, -ATTTGA ACTGGTGACACGAG-3， 2.检测试剂：包括试剂G， 试剂G中含有20倍SYBRGreen I荧光染料20-40 μ L。 3. -种使用快速检测金银花的试剂盒快速检测金银花的方法，依次包括下列步 骤： a)聚合酶链式反应扩增：包括对照PCR和鉴别PCR， 对照PCR使用权利要求1所述试剂A，B，C，D，PCR反应参数为94°C预变性5min 后，进行30次循环，循环参数为94°C 30s，55-65°C 30s，72°C 45s，后延伸72°C 5min，获得扩 增产物； 鉴定PCR使用权利要求1所述试剂A，B，E，F，PCR反应参数为85-95°C预变性Imin 后，进行30次循环，循环参数为85-95°C 30s，60-70°C 30s，获得扩增产物； b)检测：直接在所述扩增产物中加入2 μ L权利要求1所述试剂G，振荡30s充分 混匀，于365nm紫外灯下检测PCR产物；如果反应产物发出强烈绿色荧光，则确定所检材料 为金银花。 本专利技术采用荧光检测方法检测PCR扩增产物，不需电泳使得检测时间大大缩短， 且仅需简易紫外灯即可完成操作，不需要使用电泳设备和凝胶成像系统。 使用本专利技术中涉及的快速检测金银花的试剂盒可以在30分钟内完成金银花的检 测，为金银花鉴定提供了一种实用的技术。【附图说明】 图1快速PCR鉴别金银花类中药材荧光检测结果。1-2 :金银花（山东）；3_4 :金 银花（河南）；5_7 :红腺忍冬；8 :空白。【具体实施方式】 1.快速位点特异性PCR引物设计 利用忍冬的 trnL-trnF 序列 625 位 G/T 位点，通过 Premier Primer5. 0 (http:// www. premierbiosoft. com/primerdesign/)设计快速位点特异性PCR引物，调整参数使上 游引物为3'末端与625位G/T的SNP位点互补，Tm值为65-70°C，在引物3'末端倒数第二 位引入人为错配，PCR产物长度为60-100bp。引物命名为E和F，由上海生工生物科技有限 公司合成。 2快速PCR方法的建立 2. 1模板DNA提取 取20mg干燥材料（详见表1)，使用碱裂解法提取总DNA，所提取DNA稀释50倍用 于PCR反应。通用引物对trnL. F/trnL. R用于PCR反应以检测DNA质量，PCR反应体系包含 2 μ LlOXTaq buffer、1 μ L10mmol/LdNTPs、0. 25 μ mol/L 引物 C 和 D、0. 5UTaq 酶、IOngDNA, 反应程序：94°C预变性5min后进行30次循环，循环参数为94°C 30s，55-65°C 30s，72°C 45s， 后延伸72°C 5min，获得扩增产物。 表1样品表 2. 2金银花鉴别PCR反应体系的建立 使用快速PCR对金银花及其9种同属伪品进行扩增，PCR扩增条件为PCR反应参 数为85-95°C预变性Imin后，进行30次循环，循环参数为85-95°C 30s，60-70°C 30s，获得 扩增产物。反应结束后在扩增产物中加入2 μ L20 X SYBR Green I于365nm紫外波长下检 测荧光。结果如图1所示，金银花正品显示出明亮绿色荧光，而伪品不发出荧光。【主权项】1. 一种快速检测金银花药材的试剂盒，包括： a) 聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂A，B和反应引物试剂C，D，E，F， 试剂A中含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为 2. 0-5. 0 ii L、0. 5-2. 5 个单位和 10-35 ii L ; 试剂B中含有dNTP，含量为10-200 ii M ; 试剂C和D为通用引物，含量分别为0. 1-lii M，其序列为： C :5' -TTATCCTTTTTTTGTTAGCGGTTTC-3' D :5' -CTCAGATCTATTTGTAAAGAAGTAAGGTGG-3' 试剂E和F为金银花引物，含量分别为0. 1-1 iiM，其序列为： E :5, -CGAAATCGGTAGACGCTACG-3' F :5, -ATTTGAACTGGTGACACGAG-3' b) 检测试剂：包括试剂G， 试剂G中含有20倍SYBR Green I荧光染料20-40 ii L。2. -种使用权利要求1中的试剂盒快速检测金银花的方法，依次包括下列步骤： a) 聚合酶链式反应扩增：包括对照PCR和鉴别PCR， 对照PCR使用权利要求1所述试剂A，B，C，D，PCR反应参数为94°C预变性5min后，进 行30次循环，循环参数为94°C 30本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测金银花药材的试剂盒，包括：a)聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂A，B和反应引物试剂C，D，E，F，试剂A中含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.0‑5.0μL、0.5‑2.5个单位和10‑35μL；试剂B中含有dNTP，含量为10‑200μM；试剂C和D为通用引物，含量分别为0.1‑1μM，其序列为：C：5’‑TTATCCTTTTTTTGTTAGCGGTTTC‑3’D：5’‑CTCAGATCTATTTGTAAAGAAGTAAGGTGG‑3’试剂E和F为金银花引物，含量分别为0.1‑1μM，其序列为：E：5’‑CGAAATCGGTAGACGCTACG‑3’F：5’‑ATTTGAACTGGTGACACGAG‑3’b)检测试剂：包括试剂G，试剂G中含有20倍SYBR Green I荧光染料20‑40μL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，袁媛，蒋超，李曼，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。