一种鉴定芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的方法。该方法包括：1、芥蓝DNA的提取及纯化；2、用获得的芥蓝DNA为模板进行PCR分析；3、在DNA扩增电泳图中只有真的雄性不育杂交种中能扩增出249bp大小的条带，而混入的杂交父本自交种子，即假杂交种中无相应的扩增条带。然后用真杂交种子数除以总分析的种子数，即可获得制种基地生产的芥蓝胞质雄性不育杂交种的纯度。本发明专利技术可应用于芥蓝胞质雄性不育杂交种的种子纯度鉴定，结果准确、可靠，检测迅速。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及芥蓝种子纯度鉴定技术，具体地说是应用DNA分子标记技术快速鉴定芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的方法。
技术介绍
芥蓝细胞质雄性不育性(Cytoplasmic male sterility, CMS)稳定,可免去人工去雄并能保证杂交种的杂交率，已成功应用于杂交种的配制。但是在制种过程中会由于管理措施不当使得杂交父本自交种子混入杂交种中而产生假杂种，导致种子纯度下降。因此，提高杂交种纯度是杂种优势利用研究领域的重要课题。目前，种子纯度鉴定的方法大致有三种，即大田形态、生化标记和分子标记鉴定法。传统的大田鉴定法以种子、幼苗、叶、花、果实、花粉等组织器官的颜色、形态等农艺性状作为鉴定的观测指标，在生产实践中虽然是一种较为可行的方法，但大田鉴定需要额外占用土地，周期长、花费大，不仅受季节限制，而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子的影响，鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性。大田鉴定最大的缺陷是不能及时提供种子纯度信息，不能在种子大量交易前提供有关种子的质量信息，对种子质量不能起到预先监督的作用。生化鉴定方法包括蛋白质电泳和同工酶电泳，已得到日益广泛的应用，但不能完全显示品种间的多态性，难以对亲缘关系较近的杂交种及其亲本进行有效的区分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速鉴定芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的方法，以克服现有技术存在的不足； 本专利技术的技术构思是这样的: 分子标记鉴定法是以DNA的多态性为基础的鉴定方法，可以弥补和克服在种子纯度的形态学鉴定及同工酶、种子蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题。本专利技术利用分子标记技术构建了芥蓝胞质雄性不育杂交种的特异扩增条带，可以为芥蓝胞质雄性不育杂交种的纯度鉴定和纯度检测提供科学依据，进而保护生产者和使用者的合法权益； 本专利技术运用同源序列的候选基因法(homology-based candidate gene method),根据Genebank中登记的芥蓝雄性不育or/138开放阅读框保守区序列设计了一对引物，上游引物为:TGGTCAACTCATCAGGCTC，下游引物为:GCCTCTAGGAGTAGTGAAGAAC ;使用该对引物进行PCR扩增，结果只在胞质雄性不育系配制的杂交种中扩增出749bp的条带；而父本自交种中没有扩增产物； 所说的芥蓝胞质雄性不育杂交种和父本自交种可以采用上海市农业科学院园艺研究所公开销售的产品； 芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的鉴定方法，包括如下步骤: 1)用种子提取及纯化芥蓝材料的DNA； 2)用获得的芥蓝DNA为模板进行PCR分析； 3)根据扩增条带的有、无确定胞质雄性不育杂交种的真伪； 其中所述芥蓝胞质雄性不育杂交种有其特异的扩增条带，可以与可育的父本区分开来。所述PCR扩增中采用的引物是由上海生工生物工程有限公司合成的寡核苷酸引物，上游引物为:TGGTCAACTCATCAGGCTC，下游引物为:GCCTCTAGGAGTAGTGAAGAAC。本专利技术方法可以应用于芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的鉴定，本专利技术具有如下优占-^ \\\.1、本专利技术创建了一种快速鉴定芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的方法，该方法能从遗传本质上对芥蓝种子进行鉴定，因此准确、可靠； 2、采用本专利技术对芥蓝种子样品进行纯度检测时，用目前广泛应用的快速、微量DNA提取法提取待测样品的DNA，用提取的DNA作为模板进行PCR分析，在几个小时内就可以知道该样品的扩增电泳图，能迅速判断出待测种子是真的杂交种还是父本自交种。【附图说明】: 附图为本专利技术建立的PCR扩增电泳图，其中=MSDGL 2000 DNA标识；1、2、3、4、5代表芥蓝胞质雄性不育杂交种；6、7代表芥蓝杂交种父本自交种。【具体实施方式】: 本专利技术的方法用于芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的鉴定，具体操作如下: 1、从制种基地生产的“芥杂I号”或其它芥蓝胞质雄性不育杂交种子中随机抽取50-80粒； 2、芥蓝DNA的提取及纯化: 按如下程序提取各粒芥蓝种子的DNA: 每次取I粒种子，置于经-20°C冰箱降过温的研钵中磨碎，转入1.5 mL的离心管中，加入 0.35mL 的 55 °C 预热过的 IXDNA 提取液(50mmol/LTris-HCl pH7.5，1mmol/LEDTApH8.0,0.7 mmol/L NaCl, 1% β -巯基乙醇，1% CTAB)，3min 后加入 2 XDNA 提取液(浓度为前者的两倍)，放入55°C培养箱中过夜，其间颠倒数次，加入0.7mL饱和酚，在自制的混勻器(2r/min)上混勻抽提3h, 6000 r/min下离心1min,将上清液转入至另一管中，力口入0.35mL饱和酌.和0.35 mL氯仿-异戍醇(24:1)抽提2 h, 6000 r/min下离心10 min,取上清液至另一管中，加入0.7 mL氯仿-异戊醇(24:1)抽提2 h，6000 r/min下离心lOmin，取上清液至另一管中，加入0.07mL 3mol/LNaAc和0.7 mL异丙醇，室温下沉淀30min，3000r/min下离心5min,弃上清液,用70%酒精洗漆DNA,吹干,溶于100 μ L (或适量)TE中，并在I %琼脂糖凝胶上电泳，用标准λ DNA作对照，估算DNA样品的浓度，获得高纯度DNA ； 3、用获得的高纯度芥蓝DNA为模板进行分子标记分析:PCR 反应体系为 20 μ L，包括:ddH20 6.4 μ L，25mmol/l MgCl2 2.0 μ L, 10XPCR Buffer2.0μ L, dNTP ο.4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L，1ng/μ L 引物 3.0 μ L，1ng/μ L模板DNA3.0 μ L，加盖一滴矿物油进行扩增；PCR扩增程序为:94°C预变性5min ;94°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸1.5min，35个循环;72°C延伸1min后4°C保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析； 4、按照PCR扩增结果鉴定芥蓝杂交种种子的纯度: 使用上游引物 TGGTCAACTCATCAGGCTC 和下游引物 GCCTCTAGGAGTAGTGAAGAAC 进行 PCR扩增，结果应该在胞质雄性不育系配制的杂交种子中扩增出749bp的条带，为真的杂交种子；而父本自交种子中没有扩增产物，即为假的杂交种子。然后用真杂交种子数除以总分析的种子数，即可获得制种基地生产的芥蓝胞质雄性不育杂交种的纯度，较大田种植调查纯度既省时又便捷，可以为芥蓝胞质雄性不育杂交种的销售及时提供纯度信息。如果鉴定的纯度低于95%，就不能够作为种子进行销售，以避免假种子伤农事件的发生。如果鉴定的种子纯度高于98%以上，就可以作为精品种子销售，优质优价，使农民和种子经销商均获得好的经济效益。【主权项】1.，其特征在于，包括如下步骤: 1)提取及纯化芥蓝样品的DNA； 2)用获得的芥蓝DNA为模板进行PCR分析； 3)在DNA扩增电泳图中只有真的雄性不育杂交种中能扩增出249bp大小的条带，而混入的杂交父本自交种子，即假杂交种中无相应的扩增条带。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定芥蓝胞质雄性不育杂交种纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提取及纯化芥蓝样品的DNA；2)用获得的芥蓝DNA为模板进行PCR分析；3) 在DNA扩增电泳图中只有真的雄性不育杂交种中能扩增出249bp大小的条带，而混入的杂交父本自交种子，即假杂交种中无相应的扩增条带。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薄天岳，邰翔，陈锦绣，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，上海科立特农科集团有限公司，上海科园种子有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31