基因EHD2在制备乳腺癌免疫组化诊断试剂中的应用制造技术

基因EHD2在制备乳腺癌免疫组化诊断试剂中的应用，所述EHD2的国际通用序列编号为：NM_014601。其特征是采用了一种对人EHD2蛋白特异的抗体，所述抗体能特异性识别人EHD2蛋白，所述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQ ID NO：1-543。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体是EHD2的表达与亚细胞定位与乳腺癌患者的生 存具有显著相关性，可以作为乳腺癌恶性度诊断和预后预判的一个分子指标。
技术介绍
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤。全世界每年有一百万妇女患病，自20世纪70年代 末开始、我国乳腺癌的发病率一直居女性肿瘤的首位。北美、北欧原是乳腺癌的高发区，现 在我国的发病率也从五年前的十万分之十七增加到去年的十万分之五十二，呈快速上升趋 势，而且发病年龄也越来越年轻化，年龄最小的只有十四岁。引发乳腺癌的因素是多方面 的，除遗传因素外还有环境因素、精神因素及工作压力太大等因素。而且经济越发达的城市 发病率越高于农村。目前世界各国投入较大的精力和物力来研究该病的发生、发展，以便采 取积极的预防措施。 目前在临床上对肿瘤的恶性度判别主要还是基于在组织病理水平对肿瘤组织和 肿瘤细胞进行常规形态学观察，它对癌细胞的分化程度和侵犯特性有较强的辨别能力，准 确率可达50%_75%。然而，这种基于形态学的解读一方面受病理医师经验等人为因素影响， 另一方面缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据，因此亟需与现代分子技术 相结合，才能提高判断的准确性和特异性，特别是为个体化治疗路径与方案的选择提供理 论依据。 虽然肿瘤的发生与多种因素相关，但最终的根源主要来自于基因水平的异常变 化，包括基因的扩增、突变、缺失、异位等等，导致维持细胞正常生理状态所需的多个功能蛋 白在表达水平的高低、生化活性的强弱、甚至亚细胞结构分布等方面产生变化，当这种变化 赋予了细胞无限增殖能力及转移能力，并不能被体内外保护机制逆转或杀灭时，便产生了 肿瘤。因此，对肿瘤恶性本质的深刻认识和有效控制的前提是明确这些功能蛋白分子的异 变情况，这需要借助免疫组织化学的手段。 免疫组织化学技术应用免疫学抗原抗体反应基本原理，通过抗体对体内蛋白质分 子抗原的特异性识别，以及化学标记（荧光素、酶、金属离子、同位素等）的第二抗体的显色 等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肽和蛋白质）的表达量及其亚细胞定位。近年来， 随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制 认识的不断深入，免疫组化在肿瘤诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。比如雌激 素受体ER、孕激素受体PR和表皮生长因子受体家族的Her2已经被广泛用于乳腺癌的临床 分子病理诊断，它对乳腺癌的病理分类和临床用药起到了积极的指导作用。这些成果离不 开肿瘤基础研究的进步，并期待新的分子指标被进一步揭不和纳入临床应用，不断提1?肿 瘤诊治水平。EHD2基因及其编码蛋白即可能是这种新的分子指标。 EHD2(Epsin homology(EH)-domain-containing proteins)属于EHD蛋白的一种， 是一类新型膜转运调控蛋白，含有高度保守的EH结构域，此结构域是一个含有约一百个 氨基酸残基的片段，早先发现于EGFR的激酶底物Epsl5 (Epdemal Growth Factor Receptor Pathway Substrate ClonelShEHDZ参与胞膜转运的各步调控，包括内转及前、后内含体的 过渡和调控循环通路；膜及膜蛋白的各路调节，包括消化降解及循环再生。是整个胞膜转运 机制的必不可少的重要环节，对在各种细胞活动中维护物料传输信号传导的动态平衡起着 关键的作用，它的失调将导致信号应答失当，细胞功能紊乱，并可能进而引发疾病。 中国文献"EHD2干扰影响永生化乳腺上皮细胞的增殖和迁移"（王洪玉等，中国肿 瘤临床，2011年第38卷第11期，）公开了在乳腺肿瘤中EHD2的基因表达失调下降，提示该 基因可能是一个新的乳腺抑癌基因。然而在进一步免疫组化研究中我们发现，虽然EHD2在 总体表达量上呈现下降的趋势，但这种趋势主要在核中；相反，细胞浆中的表达却有升高的 趋势。而且，EHD2在核中的表达水平与患者的生存情况密切相关。因此对EHD2进行免疫 组化检测将更客观准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床预后情况。 现有的商业化EHD2抗体有十余种，由主流抗体试剂公司Santa Cruz和Abcam等 提供，但是均属于基础研究用试剂，没有依据表明这些抗体可以和我们的抗体一样具有合 格的特异性并可用于免疫组化检测，特别是目前尚没有任何其它EHD2抗体经过大量组织 标本的免疫组化验证并显示出可以通过对EHD2的亚细胞异常定位检测来达到对肿瘤的恶 性度及患者生存情况进行预后预判的目的。与本专利申请抗体相比它们有如下缺陷： 1、根据本领域公知常识，能够用于免疫组化（IHC)的抗体会在其使用说明中作 出明确标识和注明，按这些抗体的说明所示，大多数都不能用于免疫组化（IHC)检测。虽 然个别抗体标明可用于免疫组化（IHC)，但仔细研究发现并非如此。一个是南京森贝伽公 司代理的EHD2抗体，但是注明了只能检测膜定位。另一个是Proteintech公司的货号为 11440-1-AP的抗体，然而此抗体的特异性存在问题：首先免疫印迹检测得到的主要信号位 置明显小于60kD，而70kD的正常位置信号却很弱，说明虽然可以检测到EHD2,但更多检测 到的是其它未知分子；其次从公司发表的该抗体对肺癌组织的免疫组化图中可见染色信号 为明显的基质成分的非特异性着色。 2、这些抗体均为研究用试剂，没有经过大样本临床病例试验或验证，没有关键的 对EHD2的核定位检测能力，因此也就没有"通过对EHD2的亚细胞异常定位检测来达到对肿 瘤的恶性度及患者生存情况进行预后预判的目的"的前提条件与基础。 3、均没有经过严格的免疫印迹特异性验证，特别是与EHD2蛋白的同源蛋白EHD1、 EHD3、EHD4的交叉反应的免疫印迹实验验证，而这些验证对EHD2的免疫组化检测方法来说 尤其重要，因为它们之间具有很高的同源性（>70%)。 中国文献"EHD2下调促进乳腺上皮细胞转化的研究"(田刚等，现代医学检验杂志， 2012年第27卷第1期，49-51)公开了一种由其自制的EHD2抗体，这一抗体是采用我们的 没有经过抗原纯化的抗体，可以用于免疫印迹检测，但不能满足免疫组化检测的高度特异 性要求。
技术实现思路
我们在免疫组化研究中发现，正常上皮细胞中EHD2主要分布在细胞核，同时细胞 浆与膜中也有少量表达。但在乳腺癌组织中，EHD2的定位发生异变，核分布显著下降，浆 与膜分布却出现升高的趋势。临床因素分析结果表明，EHD2的核分布情况与患者预后紧密 相关，核表达越弱则患者的生存情况越差。这些发现表明乳腺癌的恶性度与癌组织细胞中 EHD2蛋白的表达位置和表达水平发生异变的程度密切关联，而免疫组化技术是检测这种表 达紊乱程度的唯一可靠手段。因此提供一种检测EHD2基因的表达产物在癌细胞内部不同 位置特别是核中的表达情况的方法为现有技术中需要解决的问题。 为了解决上述问题，本专利技术提供了以下技术手段和方案： 一种对人EHD2蛋白特异的抗体，其特征是所述抗体能特异性识别人EHD2蛋白，所 述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQ ID N0:l-543。 基因 EHD2及其编码蛋白在乳腺癌免疫组织化学法诊断和预后预判中的应用，所 述基因 本文档来自技高网...

【技术保护点】
基因EHD2及其编码蛋白在制备乳腺癌免疫组织化学法诊断和预后预判试剂中的应用，所述EHD2的国际通用序列编号为：NM_014601。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：应国光，刘博，
申请(专利权)人：天津市应世博科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12