一种多交叉置换扩增核苷酸片段的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种多交叉置换扩增核苷酸片段的方法及应用，所述方法提供一对交叉引物、一对置换引物，以及3～6条扩增引物恒温扩增目的基因片段并进行可视化检测、电泳检测或实时浊度检测。本方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种多交叉置换恒温扩增技术，属于分子生物学领域。
技术介绍
在现代生物学和医学领域，核酸扩增是一种不可缺少的技术，广泛运用于基础研 宄、临床诊断、考古研宄、流行病研宄、转基因研宄等领域。在已经发展的核酸扩增技术中， PCR是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，现已被广泛运用于生物相关领 域。然而，PCR进行核酸扩增时，受实验室的条件限制，依赖于复杂昂贵的热循环仪器。此 外，PCR产物的检测比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。这些劣势限制了该技术的广泛 应用，尤其在经济落后的地区及快速诊断领域。因此，对于生物相关研宄领域而言，非常有 必要发展一个简单、快速、敏感的核酸扩增方法。 为了克服PCR扩增技术的劣势，应运而生了许多恒温扩增技术。较PCR技术而言， 恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。有利于实现快速扩增，便 捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10种，应用较为广泛的有滚环 扩增（RCA)、链置换扩增（SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增（HDA)、环介导恒温扩增（LAMP)、交 叉扩增（CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试 剂，复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速 诊断领域及欠发达地区。 为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩 增核酸序列，在生物、农业、医学等领域，有必要发展一种操作简单、经济实用、反应快速、特 异性强的核酸扩增技术。 另外一方面，单增李斯特菌是广泛存在于环境中的革兰氏阳性、有运动能力、兼性 胞内寄生短杆菌，是重要的食源性人兽共患病原菌，能够引起人类严重感染。李斯特菌病的 易感者主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生儿和孕妇；后者为肿 瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类李斯特菌病的主要临床症状为发热性胃肠炎、 败血症、脑膜炎、孕妇流产、死产等，该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障。单增李斯 特菌病在人类的感染率虽不高，但该病因其死亡率极高而受到广泛关注，成为欧美国家重 大公共卫生问题之一。国内尚无由单增李斯特菌引起食物中毒暴发的报道，实际存在与否 不明，散发病例在多个省市都有报道。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗和单增李斯 特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的单增李斯特菌检测方法成为必 要。目前对于单增李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法 耗时大约5到7天，包括二次增菌，选择性培养及后续的生化鉴定，其劣势在于耗时耗力，生 化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速 发展，一些以PCR为基础的诊断技术（如普通PCR技术，荧光PCR技术）被用于单增李斯特 菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合 成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。因而， 急需发展一种简单、快速、灵敏和特异的诊断技术用于单增李斯特菌检测。
技术实现思路
基于现有技术存在的问题，本专利技术建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉 置换扩增（Multiple Cross Displacement AmplificatioruMCDAhMCDA在恒温条件下实现 核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。因此，MCDA作为一种 新的核酸扩增技术，能够广泛的用于生物相关领域，实现核酸的快速扩增及分子诊断分析。 -方面，本专利技术首先提供了一种扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测的方 法，所述方法包括以下步骤： (1)自所述目的基因片段的3'端起，设定第一任意序列Fls，第二任意序列Pls，自 所述目的基因片段的5'端起，设定第三任意序列F2,第四任意序列P2,在所述第二任意序 列Pls的5'端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3'端设定第六任意 序列C2s ; (2)提供置换引物F1，所述引物Fl含有与序列Fls互补的序列，提供交叉引物 CP1，所述引物CPl自5'端依次含有序列Cl和与序列Pls互补的序列P1，提供置换引物F2， 所述引物含有序列F2,提供交叉引物CP2,所述引物CP2自5'端依次含有序列C2s互补的 序列C2和序列P2 ; ⑶提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列Cl的扩增引物C1，和/或含有与 序列C2s互补的扩增引物C2; (4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模 板恒温扩增DNA ; (5)检测步骤⑷的扩增结果。 在一个优选的技术方案中，只在目的片段的一端提供扩增引物，本专利技术将其命名 为单-多交叉置换扩增（S-MCDA)，其中，在步骤（1)中所述序列Cl的3'端和5'端分别设 定第七任意序列Dl和第八任意序列R1，步骤（3)所述的扩增引物还包括含有序列Dl的 扩增引物Dl和含有序列Rl的扩增引物Rl ;该技术方案被命名为单-1-多交叉置换扩增 (S1-MCDA);或者 在步骤（1)中序列C2s的5'端和3'端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序 列R2s，步骤（3)所述的扩增引物还包括含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列 R2sS补的扩增引物R2。该技术方案是上述技术方案的一个替换技术方案，本专利技术将其命 名为单-2-多交叉置换扩增（S2-MCDA)。 在一个更为优选的技术方案中，在目的片段的两端都提供扩增引物，本专利技术将其 命名为双-多交叉置换扩增（D-MCDA)，其中，在步骤（1)序列Cl的3'端和5'端分别设定 第七任意序列Dl和第八任意序列R1，在序列C2s的5'端和3'端分别设定第九任意序列 D2s和第十任意序列R2s，步骤（3)所述的扩增引物还包括含有序列Dl的扩增引物D1、含有 序列Rl的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增 引物R2。 优选地，步骤（4)中所述扩增是在60~67°C中进行的。 更为优选地，步骤（4)中所述扩增是在63°C中进行的。 优选地，步骤（4)中所述链移位型聚合酶为Bst DNA聚合酶、所述解链温度调节剂 为甜菜碱。 优选地，步骤（5)所述的检测为可视染料检测、电泳检测或实时浊度检测。MCDA扩 增之后，三种主流的检测方法被用于MCDA扩增判读。首先，MCDA产物可以通过琼脂糖凝胶 电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图 呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。其次，实时浊度检测也被用于检测MCDA扩增。 更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料（如FD试剂，朗普荧光可视试剂），阳性反 应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。 另一方面，本专利技术提供了上述方法在检测单增李斯特菌中的非诊断目的的应用， 在一个优选技术方案中，所述应用可以是所谓的单-多交叉置换扩增（S-MCDA)。在一个具 体实施方案中，所述交叉引物CPl的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述交叉引物CP2的序列如 SEQ ID NO:2所示，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2；(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2；(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；(5)检测步骤(4)的扩增结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶长芸，王毅，王艳，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11