从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法技术

本发明专利技术涉及从人微量Ｂ细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，该方法应用独创的ＲＴ－Ｎｅｓｔ－ＰＣＲ技术和基于生物信息学基础上的集群引物的设计，从人的微量（１０个）Ｂ细胞中扩增出人抗体重链和轻链可变区基因片段能涵盖目前所有已报导的人抗体的基因。本发明专利技术有利于克隆，表达和重组出人抗各类肿瘤相关抗原和传染病抗原的人单克隆抗体，是一条创新的用基因工程方法研制人单克隆抗体的关键技术。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
从人微量Ｂ细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：　（１）从人全血中分离Ｂ细胞及Ｂ细胞的保存　１）人全血预处理　ＥＤＴＡ或柠檬酸进行抗凝处理的人全血加入二倍体积的缓冲液（含有０．１％ＢＳＡ ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ的ＰＢＳ缓冲液）离心后，去上清，在血细胞中加入等体积上述溶液混匀后，用于Ｂ细胞的分离；　２）人Ｂ细胞的分离　用包被抗ＣＤ１９抗体的磁珠方法从人全血中分离人Ｂ细胞；　３）人Ｂ细胞的保存　分离得到的Ｂ细 胞用冻存液（含１０％胎牛血清，１０％ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ）冻存于液氮中，该冻存方法至少在２年内可保持细胞膜及ＲＮＡ的完整；　（２）集群引物来源和设计　１）搜寻γ重链及λ、κ轻链的基因序列　应用生物信息学的方法从基因库获得文献 已报导的所有的人抗体的γ重链及λ、κ轻链的基因序列；　２）分拣，归类各γ重链及λ、Ｋ轻链的基因序列　将上述搜索到的基因分类为γ、λ、κ三组基因序列，在各组序列中进行一系列对比，并将相似的序列进行兼并；　３）人抗体γ重链及λ 、Ｋ轻链的集群引物设计　由于是用微量的Ｂ细胞扩增人γ重链及λ、κ轻链的基因序列，所得到的模板的量十分稀少，因此设计了ｎｅｓｔ－ＰＣＲ：即通过两次ＰＣＲ的方法来扩增目的γ重链及λ、κ轻链的基因片段，为此设计了两组集群引物：　ａ．第 一次ＰＣＲ引物：长２１ｂｐ，γ重链引物为１８对，λ轻链引物为３５对，κ轻链引物为３３对；　ｂ．第二次ＰＣＲ引物：长４９ｂｐ，在第一次ＰＣＲ引物的基础上，５’引物加上ＡｓｃＩ酶切位点及信号肽序列，３’引物向上游移动了２０ｂｐ，形成巢式结 构，并引入了ＮｏｔＩ酶切位点，这使ＰＣＲ效率及稳定性大为提高，减少了ＰＣＲ反应的非特异性产物，并使所获得的人抗体的轻、重链功能性片段可直接进行克隆及表达；　（３）人Ｂ细胞中抗体相关基因的扩增　１）从１０个人Ｂ细胞中获取微量ｍＲＮ Ａ　用裂解缓冲液（Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｗｉｔｈ　Ｌｙｓｉｓ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）逐级稀释Ｂ细胞，准确地取１０个Ｂ细胞，置于２００微升薄壁ＰＣＲ管中，并配置裂解反应体系，体系中含ｏｌｉｇｏ－ｄ（Ｔ）↓［２０ ］　３．８５ｕＭ及ＲＮａｓｅ　ＯＵＴ　３．０８Ｕ，轻柔混合后，置ＰＣＲ仪中７５℃保温１０分钟，立即插入冰中至完全冷却；　２）用...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚祖埙，吴鸿菲，吴建华，张祖传，张奉武，沈菊英，姚亚媄，
申请(专利权)人：上海凯勃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]