杰克贝尔氏粉蚧特异性SS‑COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的，本发明专利技术涉及杰克贝尔氏粉蚧特异性SS‑COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒。该引物提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在杰克贝尔氏粉蚧检测监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、蔬菜和水果生产基地、鲜切花和苗木生产基地，以及水果、蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。

Jack Bell S mealybug specific SS COI primers and rapid PCR detection method and kit

The present invention relates to the field of molecular biology, in particular, the invention relates to a Jack Bell S mealybug specific SS COI primers and rapid PCR detection method and kit. \u8be5\u5f15\u7269\u63d0\u9ad8\u4e86\u68c0\u6d4b\u7684\u51c6\u786e\u6027\u548c\u7075\u654f\u5ea6\uff0c\u8282\u7ea6\u4e86\u68c0\u6d4b\u65f6\u95f4\uff0c\u5728\u6770\u514b\u8d1d\u5c14\u6c0f\u7c89\u86a7\u68c0\u6d4b\u76d1\u6d4b\u65b9\u9762\u5177\u6709\u5f88\u9ad8\u7684\u5e94\u7528\u4ef7\u503c\uff0c\u53ef\u4ee5\u8bd5\u5242\u76d2\u7684\u5f62\u5f0f\u5728\u6211\u56fd\u53e3\u5cb8\u3001\u852c\u83dc\u548c\u6c34\u679c\u751f\u4ea7\u57fa\u5730\u3001\u9c9c\u5207\u82b1\u548c\u82d7\u6728\u751f\u4ea7\u57fa\u5730\uff0c\u4ee5\u53ca\u6c34\u679c\u3001\u852c\u83dc\u3001\u89c2\u8d4f\u690d\u7269\u3001\u679c\u6811\u79cd\u82d7/\u690d\u682a\u8c03\u8fd0\u4e2d\u63a8\u5e7f\u3002

【技术实现步骤摘要】
杰克贝尔氏粉蚧特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的，本专利技术涉及杰克贝尔氏粉蚧特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒。
技术介绍
杰克贝尔氏粉蚧(JackBeardsleymealybug)PseudococcusjackbeardsleyiGimpel&Miller属半翅目、粉蚧科、粉蚧属，是我国进境水果上一种具有重要检疫意义的有害生物，寄主范围十分广泛。随着中国东盟自由贸易区政策的推进，我国从东南亚进境的水果越来越多，杰克贝尔氏粉蚧入侵的风险越来越大，因此，加强对杰克贝尔氏粉蚧的检测监测，是保障我国水果、蔬菜和花卉产业健康发展的必要前提。目前国际上用于杰克贝尔氏粉蚧鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定；2)DNA序列测定法等。但目前尚没有针对杰克贝尔氏粉蚧标准的检测方法。SS-COIPCR技术检测是在mtDNACOI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有高灵敏度、特异性强、快速、简便且重现性好和稳定性强等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供杰克贝尔氏粉蚧特异性SS-COI引物对。本专利技术的再一目的为提供一种杰克贝尔氏粉蚧特异性基因片段。本专利技术的另一目的为提供一种杰克贝尔氏粉蚧的特异性快速PCR检测方法。本专利技术的再一目的为提供一种杰克贝尔氏粉蚧的特异性快速PCR检测试剂盒。本专利技术根据杰克贝尔氏粉蚧的线粒体DNA序列，设计筛选出了一对特异性引物，该对引物只对杰克贝尔氏粉蚧具有扩增能力。是对杰克贝尔氏粉蚧形态学检测鉴定和mtDNACOI技术检测方法的补充和改进。同时，该方法采用SS-COI技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在杰克贝尔氏粉蚧检测监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、蔬菜和水果生产基地、鲜切花和苗木生产基地，以及水果、蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。根据本专利技术的杰克贝尔氏粉蚧特异性SS-COI引物为：引物PJZWF1：5’-GTACCATTAATAATAATATCTAG-3’；和引物PJZWR1：5’-ATGTAACAATAATAGATCAAATATAAAGTGT-3’。根据本专利技术的杰克贝尔氏粉蚧特异性基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。根据本专利技术的杰克贝尔氏粉蚧特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行PCR扩增的步骤。根据本专利技术的杰克贝尔氏粉蚧特异性检测试剂盒包括上述杰克贝尔氏粉蚧特异性SS-COI引物。本专利技术的杰克贝尔氏粉蚧种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测杰克贝尔氏粉蚧。与国际现有方法相比，本专利技术具有以下的技术优势：(1)检测准确性高，利用本专利技术的杰克贝尔氏粉蚧种特异性SS-COI标记引物PJZWF1和PJZWR1，在PCR快速检测杰克贝尔氏粉蚧时，可扩增出319bp的片段，不仅对杰克贝尔氏粉蚧单头成虫、2龄和3龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵若虫也能准确检测。(2)操作简便快捷，本专利技术采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个过程可在4小时内完成。(3)特异性强：本专利技术设计的引物可特异性检测杰克贝尔氏粉蚧，在其近缘种、属粉蚧中无扩增产物。因此本专利技术的杰克贝尔氏粉蚧特异性检测方法实用性强，可满足植物检疫及害虫检测和监测的需要。附图说明图1显示6对杰克贝尔氏粉蚧特异性候选引物对杰克贝尔氏粉蚧及其近缘种粉蚧的扩增结果，其中，A：PJZWF1/PJZWR1；B：PJZWF1/PJZWR2；C：PJZWF2/PJZWR1；D：PJZWF2/PJZWR2；E：PJZWF3/PJZWR1；F：PJZWF3/PJZWR2。M：分子量标准Trans2KTM；1：杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcusjackbeardsleyi；2：榕树粉蚧Pseudococcusbaliteus；3：康氏粉蚧Pseudococcuscomstocki；4：桔小粉蚧Pseudococcuscryptus；5：Pseudococcussp.；6：暗色粉蚧Pseudococcusviburni；7：新菠萝灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes；8：双条拂粉蚧Ferrisiavirgata；9：扶桑绵粉蚧Phenacoccussolenopsis；10：大洋臀纹粉蚧Planococcusminor；11：阴性对照(超纯水)。图2显示特异性引物PJZWF1/PJZWR1对杰克贝尔氏粉蚧及其近缘种、属粉蚧的SS-COIPCR扩增结果，其中，M：分子量标准Trans2KTM；1：杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcusjackbeardsleyi；2：榕树粉蚧Pseudococcusbaliteus；3：康氏粉蚧Pseudococcuscomstocki；4：桔小粉蚧Pseudococcuscryptus；5：Pseudococcussp.；6：暗色粉蚧Pseudococcusviburni；7：菠萝粉蚧Dysmicoccusbrevipes；8：新菠萝灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes；9：Ferrisiagilli；10：双条拂粉蚧Ferrisiavirgata；11：木槿曼粉蚧Maconellicoccushirsutus；12：橘鳞粉蚧Nipaecoccusviridis；13：木瓜秀粉蚧Paracoccusmarginatus；14：美地绵粉蚧Phenacoccusmadeirensis；15：木薯绵粉蚧Phenacoccusmanihoti；16：石蒜绵粉蚧Phenacoccussolani；17：扶桑绵粉蚧Phenacoccussolenopsis；18：柑橘臀纹粉蚧Planococcuscitri；19：日本臀纹粉蚧Planococcuskraunhiae；20：南洋臀纹粉蚧Planococcuslilacinus；21：大洋臀纹粉蚧Planococcusminor；22：蔗茎红粉蚧Saccharicoccussacchari；23：阴性对照(超纯水)。图3显示特异性引物PJZWF1/PJZWR1对杰克贝尔氏粉蚧不同虫态、龄期和残体以及不同寄主植物标本的SS-COIPCR扩增结果，其中，M：分子量标准Trans2KTM；1-4：寄主植物为木薯，1：单粒卵；2：1龄若虫；3：2龄若虫；4：3龄若虫；5-9：雌性成虫，5：寄主植物为木薯；6：寄主植物为火龙果；7：寄主植物为丝瓜；8：寄主植物为人参榕；9：寄主植物为莲雾；10-12：寄主植物为火龙果，10：头部；11：胸部；12：腹部；13：阴性对照(超纯水)。图4显示特异性引物PJZWF1/PJZWR1对杰克贝尔氏粉蚧检测阈值的测定，其中，M：分子量标准Trans2KTM；1-15分别为，1：1/40；2：1/80；3：1/160；4：1/320；5：1/640；6：1/1280；7：1/2560；8：1/5120；9：1/10240；10：1/20480；11：1/40960；12：1/81920；13：1/163840；14：1/327680；15：1/655360头雌性成虫；本文档来自技高网...

【技术保护点】
杰克贝尔氏粉蚧特异性SS‑COI引物，其特征在于，包括以下引物：引物PJZWF1：5’‑GTACCATTAATAATAATATCTAG‑3’；和引物PJZWR1：5’‑ATGTAACAATAATAGATCAAATATAAAGTGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.杰克贝尔氏粉蚧特异性SS-COI引物，其特征在于，包括以下引物：引物PJZWF1：5’-GTACCATTAATAATAATATCTAG-3’；和引物PJZWR1：5’-ATGTAACAATAATAGATCAAATATAAAGTGT-3’。2.杰克贝尔氏粉蚧特异性基因片段，其特征在于，所述基因片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉生，张桂芬，田虎，冼晓青，刘万学，张毅波，郭建洋，万方浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11