用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针，引物对上、下游引物的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2；探针的核苷酸序列为序列表中的序列3；还公开了快速检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒，是建立在分子生物学基础上的，该引物和探针能够特异性的扩增捻转血矛线虫，提供的快速检测捻转血矛线虫核酸的试剂盒，敏感性高于PCR，特异性强，检测速度快，结果的判定操作极其简便；本发明专利技术提供检测方法和检测试剂盒，结合已有的核酸快速提取方法，能够在非实验室环境下实现养殖场现场检测，从而及时采取措施，以达到净化捻转血矛线虫的目的。

Primer pairs, probes and rapid detection kits for the detection of the nucleic acid of spear spear

The invention discloses a primer for detection of Haemonchus contortus nucleic acid and to probe primers on the upstream and downstream primers of nucleotide sequences were sequence in a sequence table 1, sequence 2; nucleotide sequence of probe sequence in a sequence table 3; also discloses the rapid detection kit and detection method. The beneficial effects of the invention are: for the detection of Haemonchus contortus nucleic acid primer and probe and rapid detection kit provided by the invention, on the basis of molecular biology, the primer and probe to amplification of Haemonchus contortus specific, rapid detection test kit provides heamonchus contortus nucleic acid, sensitivity is higher than PCR, strong specificity, high detection speed, judge the results of the operation is extremely simple; the invention provides a detection method and detection kit, combined with the rapid extraction method of existing nucleic acid in non laboratory environment to realize farm site inspection, to take timely measures to achieve the purification of twist contoruts purpose.

【技术实现步骤摘要】
用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒
本专利技术涉及寄生虫检测
，具体涉及用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒。
技术介绍
捻转血矛线虫是毛圆科线虫中的一种感染反刍动物的重要寄生虫。捻转血矛线虫的雌虫产卵量高，每天可产卵5000-10000个，草场的温度、湿度、氧气、光照等都有利于虫卵孵化为侵袭性幼虫,冬季的温度又不能冻死草地上的越冬虫卵,往往造成草场的严重污染，给畜牧业带来严重的经济损失，尤其是养羊业。成虫主要寄生在羊的真胃粘膜上并吸血，感染后临床症状表现为贫血、腹泻和水肿等，甚至死亡，死亡率可高达30％左右，羔羊和小母羊可达40％。目前市场上还没有商业化的疫苗可供使用，捻转血矛线虫病的防控仍然以抗蠕虫药(如左旋咪唑，丙硫苯咪唑等)的定期驱虫为主。但是长期使用抗蠕虫药使得牧场捻转血矛线虫产生耐药性的现象普遍存在。及时检测捻转血矛线虫的感染与流行，能够为遏制捻转血矛线虫的传播起到重要作用，但是目前已有的检测方法都无法实现养殖场现场检测，无法及时获得捻转血矛线虫的感染与流行情况。综上，建立一种又准确又适用于现场检测捻转血矛线虫的方法显得尤为重要，从而能够及时采取措施，以达到净化捻转血矛线虫的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒，并提供了检测方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为5'-CAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'，即为序列表中的序列1，下游引物的核苷酸序列为5'-biotin-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCTAAATGATATG-3'，即为序列表中的序列2；所述探针的核苷酸序列为5'-FAM-TATTGAGATTGACTTAGATAGTGACTTGTA-THF-GGCGACGATGTTCTT-SpacerC3-3'，即为序列表中的序列3。本专利技术的第二个目的是提供了一种检测捻转血矛线虫核酸的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组成成分：LF-RPA引物探针混合液，LF-RPA反应预混液，PCRD试纸条和PCRD试纸条缓冲液(PCRDextractionbuffer)；所述LF-RPA引物探针混合液中，引物的核苷酸序列为权利要求1所述的序列1和序列2，探针的核苷酸序列为权利要求1所述的序列3。进一步的，上述的一种检测捻转血矛线虫核酸的快速检测试剂盒，所述LF-RPA引物探针混合液的制备方法为：将上游引物23pmol，下游引物23pmol，探针2pmol混合于16μl纯水中，-20℃保存。进一步的，上述的一种检测捻转血矛线虫核酸的快速检测试剂盒，所述LF-RPA反应预混液的制备方法为：29.5μl的RPA反应缓冲液(RehydrationBuffer)、2.5μl的280mM醋酸镁溶液(MagnesiumAcetate)和5mg的RPA冻干酶混合成32μl的溶液，-20℃保存。本专利技术的第三个目的是提供了上述一种检测捻转血矛线虫核酸的快速检测试剂盒在检测捻转血矛线虫核酸中的应用。进一步的，上述的应用，检测方法包括以下步骤：1)对捻转血矛线虫核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；扩增时所使用的引物对和探针为：上游引物：5'-CAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'，即序列表中的序列1；下游引物：5'-biotin-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCTAAATGATATG-3'，即序列表中的序列2；探针：5'-FAM-TATTGAGATTGACTTAGATAGTGACTTGTA-THF-GGCGACGATGTTCTT-SpacerC3-3'，即序列表中的序列3；将捻转血矛线虫核酸样品2μl，LF-RPA引物探针混合液16μl，LF-RPA反应预混液32μl混于反应管中，在30℃-45℃条件下反应15-20分钟，得到反应产物；2)取1μl反应产物与79μlPCRD试纸条缓冲液(PCRDextractionbuffer)混匀，全部加到PCRD试纸条的加样孔中，室温下反应10分钟后观察结果，判定是否感染，一条杠为阴性，两条杠为阳性。所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒，是建立在分子生物学基础上的，先基于捻转血矛线虫ITS-2基因设计了特定引物和探针，该引物和探针能够特异性的扩增捻转血矛线虫，再应用重组酶聚合酶扩增(RPA)-测流层析(LF)的方法制备了快速检测捻转血矛线虫核酸的试剂盒，敏感性高于PCR，特异性强，整个过程只需30分钟，结果的判定只需观察测流层析试纸条,即PCRD试纸条是否是两条杠，操作极其简便；本专利技术提供的捻转血矛线虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒结合现有专利(专利申请号为201420386073.4的技术专利或专利申请号为200920312749.4的技术专利)中提供的核酸快速提取方法，使得整个反应过程可以在非实验室环境下进行，能够实现养殖场现场检测，从而及时采取措施，以达到净化捻转血矛线虫的目的。附图说明图1显示为本专利技术的试剂盒的敏感性实验结果。图2显示为本专利技术的试剂盒的特异性实验结果。图3显示为本专利技术的试剂盒的反应条件的探索实验结果。具体实施方式本专利技术所用试剂来源：PCRD试剂盒：全称为PCRDNucleicAcidDetection，购自英国TwistDx公司，货号为PCRD3Kit。PCRD试纸条：PCRD试剂盒内提供。PCRD试纸条缓冲液(PCRDextractionbuffer)：PCRD试剂盒内提供。RPA试剂盒：全称为TwistAmpnfokit,购自英国的TwistDx公司，货号为TANFO02KIT。RPA反应缓冲液(RehydrationBuffer)：RPA试剂盒内提供。醋酸镁溶液：RPA试剂盒内提供。RPA冻干酶：RPA试剂盒内提供。实施例1：本专利技术的捻转血矛线虫核酸快速检测试剂盒包括：LF-RPA引物探针混合液，RPA试剂盒(TwistAmpnfokit，TwistDx)提供的RPA反应预混液(29.5μlRehydrationBuffer，2.5μl280mMMagnesiumAcetate混合液和5mg冻干酶)，PCRD试剂盒(PCRDNucleicAcidDetection，TwistDx)提供的PCRD试纸条和PCRDextractionbuffer。具体制备方法为：(1)LF-RPA引物探针混合液：本申请针对捻转血矛线虫的ITS-2基因设计引物和探针，具体核苷酸序列如下：上游引物：5'--CAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'；下游引物：5'-biotin-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCTAAATGATATG-3'；探针：5'-FAM-TATTGAGATTGACTTAGATAGTGACTTGTA-THF-GGCGACGATGTTCTT-SpacerC3-3'。将上游引物23poml、下游引物23pmol、探针2pmol混合于16μl纯水中，得到引物探针混合液，-20℃保存。(2)LF-RPA反应预混液得制本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针，其特征在于，所述引物对上游引物的核苷酸序列为5'‑CAAATGGCATTTGTCTTTTAG‑3'，即为序列表中的序列1，下游引物的核苷酸序列为5'‑biotin‑TTAGTTTCTTTTCCTCCGCTAAATGATATG‑3'，即为序列表中的序列2；所述探针的核苷酸序列为5'‑FAM‑TATTGAGATTGACTTAGATAGTGACTTGTA‑THF‑GGCGACGATGTTCTT‑Spacer C3‑3'，即为序列表中的序列3。

【技术特征摘要】
1.用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针，其特征在于，所述引物对上游引物的核苷酸序列为5'-CAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'，即为序列表中的序列1，下游引物的核苷酸序列为5'-biotin-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCTAAATGATATG-3'，即为序列表中的序列2；所述探针的核苷酸序列为5'-FAM-TATTGAGATTGACTTAGATAGTGACTTGTA-THF-GGCGACGATGTTCTT-SpacerC3-3'，即为序列表中的序列3。2.一种检测捻转血矛线虫核酸的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组成成分：LF-RPA引物探针混合液，LF-RPA反应预混液，PCRD试纸条和PCRD试纸条缓冲液PCRDextractionbuffer；所述LF-RPA引物探针混合液中，引物的核苷酸序列为权利要求1所述的序列1和序列2，探针的核苷酸序列为权利要求1所述的序列3。3.根据权利要求2所述的一种检测捻转血矛线虫核酸的快速检测试剂盒，其特征在于，所述LF-RPA引物探针混合液的制备方法为：将上游引物23pmol，下游引物23pmol，探针2pmol混合于16μl纯水中，-20℃保存。4.根据权利要求2所述的一种检测捻转血矛线虫核酸的快速检测试剂盒，其特征在于，所述LF-RPA反应预混液的制备方法为：2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴耀东，周东辉，王琪琪，邹扬，胡敏，徐民俊，朱兴全，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62