一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法技术

一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法，属于分子生物学鉴别技术领域。包括：1）3条上游引物和3条下游引物；2）阳性对照重组质粒模板；3）PCR反应液。上述一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法，其针对三种飞虱的ITS序列，在验证ITS区序列的基础上，设计并优化了引物对及配比，以粗组织样品为模板，节省了提取DNA的所耗费的时间和试剂，建立了更加快速、准确、灵敏、高通量、低成本地鉴别三种飞虱的多重PCR检测试剂盒及鉴别方法，为分子生物学方法鉴别褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱提供选择。

A multiple PCR kit for rapid identification of species of Planthopper and its identification method

A multiplex PCR kit for identifying the species of the Planthopper and its identification method, which belongs to the field of molecular biological identification technology. Including: 1) 3 upstream primers and 3 downstream primers; 2) positive control recombinant plasmid template; 3) PCR reaction liquid. The multiple PCR kit for rapidly identifying the species of rice planthopper and identification method, the ITS sequences for three kinds of Planthopper, based on the ITS sequence of verification, the design and optimization of the primer pairs and ratio, with crude tissue samples as templates, the cost is saved when the extraction of DNA and establishment of reagents. A more rapid, accurate, sensitive, high-throughput and low-cost identification of three BPH multiplex PCR detection kit and identification method, provide the choice for molecular biology identification of brown planthopper, Nilaparvata lugens and pseudo pseudo brown planthopper.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法
本专利技术属于分子生物学鉴别
，具体涉及一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法。
技术介绍
褐飞虱[Nilaparvatalugens(Stål)]是亚洲稻区最严重的水稻害虫之一，具远距离迁飞习性。准确的虫情预测预报是害虫防治的关键，目前主要采用灯诱监测。测报灯下褐飞虱的始见日、迁入量、迁入峰是褐飞虱预测预报的重要依据，也是褐飞虱防治策略制定的关键信息依据。拟褐飞虱[Nilaparvatabakeri(Muir)]和伪褐飞虱[NilaparvatamuiriChina]是褐飞虱的同属近似种，并不以水稻为适宜寄主。拟褐飞虱、伪褐飞虱与褐飞虱具有广泛的共同分布区域，发生季节也有交叉，且都具有趋光性，对预测预报的准确性造成了严重影响。褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱形态非常相似，肉眼难以区分，需专业植保人员借助于显微镜才能鉴别区分，耗时费力，且不能鉴别残缺的飞虱个体。聚合酶链式反应（PCR）技术以其高敏感性、高特异性等特点，被广泛应用于昆虫学领域，如系统进化树的构建等。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型DNA扩增技术，是在同一反应体系中同时加入多对引物扩增多条DNA片段，采用这一技术可实现多种昆虫种类的同步鉴别。但多重PCR检测的准确性受多种因素的影响，比如DNA聚合酶的活性、引物的特异性、PCR反应条件，不同样本对试剂的竞争等。昆虫核糖体内转录间隔区（internaltranscribedspacer,ITS）具有进化速率快，物种间差异较大而物种内比较保守，拷贝数多的特点，被广泛应用于物种鉴别。崔亚丽等（2012年）曾利用ITS区设计引物，以DNA为模板，初步建立了褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱的多重PCR检测技术，但具有耗时长、耗费大的缺点，且多重和单重引物对扩增条带长度有一定差异。基于当前现状，迫切需要建立一种快速、简便、经济的分子生物学鉴定方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于提供一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法的技术方案，其针对三种飞虱的ITS序列，在验证ITS区序列的基础上，设计并优化了引物对及配比，以粗组织样品为模板，节省了提取DNA的所耗费的时间和试剂，建立了更加快速、准确、灵敏、高通量、低成本地鉴别三种飞虱的多重PCR检测试剂盒及鉴别方法，为分子生物学方法鉴别褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱提供选择。所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于包括：1）3条上游引物和3条下游引物；2）阳性对照重组质粒模板；3）PCR反应液；其中，所述的3条上游引物和3条下游引物序列分别为：扩增褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nl-F:5’-CAACTAGGTAAGTAAAGGTGCTAC-3’Nl-R:5’-GCTTGCTGTTAAGTCACAAG-3’扩增拟褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nb-F:5’-GCTAGTCATTACATTGTATGTTGG-3’Nb-R:5’-ACTTTCTGGTCCGACTAACAT-3’扩增伪褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nm-F:5’-TGTATGATGGCAGCATTAATCT-3’Nm-R:5’-GAAATTTGTATGGTTCAATGTGTAG-3’。所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于其中所述的阳性对照为：分别含褐飞虱ITS1、拟褐飞虱ITS1、伪褐飞虱IST2区核苷酸序列的重组质粒标准品；褐飞虱IST1序列（595bp）：ACGAGCCAAGTGATCCACCACTCAGGGTAATTAAACATTTTGGTGGCTAGTCATTACAATGTATGGTGGCTATTTTGTCATTAAGTTATTCACACTAGGCAAATATGAGGGTCTCGCCTAGCCGACAAGACGAATCCCTCGAGTGTGGCAACAATTTGCAGTCAACTTGCCAATGGTGAACCTGTCATACAATGATTATGATACACACTAAACATTGAAATGACTCTAGACTCGAACCACAGGCTTGCTTCACTACTGCTGCCTTTTTGTCATGATTGCGAGCTACACATTCATTTACAACTAGGTAAGTAAAGGTGCTACAGCTACAAGCGAGATCAAGACAAGCAGTTTGTGGCCGATGTTAGTCAGACCAGACCAGGATGTGACAACAATTTGTTAGTGAAACCACCAATAGTGAATCTGTCACACAATGATGATGATACACACTCAACATTGGTATGACTCTAGACTCGAACCAAAGGCTTGTTTGACCACTGCTGTCACTATCAATAGTCTTGTGACTTAACAGCAAGCACACAGGATTTCACATTCTATTGAAATGCGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA拟褐飞虱IST1序列（607bp）：ACGAGCCAAGTGATCCACCACTCAGGGTAATTAAACATTTTGGTGGCTAGTCATTACATTGTATGTTGGCTATTTTGTCATTATTGTTTTTATTTGGCTATTCTGTCATTGAGTTATTCACACTAGGCGAATATGAGGGTCTCGCCTAGCCGACAAGACGAATCCCTCGAGTGTGGCAACAATTTGCAGTCAACTCGCCAATGGTGAACCTGTCATACAATGATGATGATACACACTCAACATTGAAATGACTCTAGACTCGAACCAAAGGCTTGCTTGACTACTGCTGCCTTCTTGTCATGACTGCGAGCTACACATTCATTTACTGTTAGATAAATGAAAGTGCTAGAGCTACAAGCAAGATCGAGACAAGCAGTTTGTGGCCTATGTTAGTCGGACCAGAAAGTGACAACAATATGTAGTCAACCCACCAATGGTGAACCTGTCATACAATGATGATGATACACACTCAACATTGAAATGACTCTAGACTCGAACCAAAGGCTTTCTTGACTACTGCTGTCACTATCAATAGTCTTGTGACTGAACAACAAAAGCACACAGGATTTCACATTCTATTGAAATGCGTTAATGATCCTTCCGCAGG伪褐飞虱IST2序列（802bp）：CTGCAGGACACATGAACATTGACATTTCGAACGCACATTGCGCCCCTTTGGGATTCTATCCCGAGGGCCATGTCTGTCTGAGGGTCGGTAATCATAAAAGCCTGAAACTGTGTTTGTCAATTGAGTCTTCATATTGTGTTGATTAAATTCCACTTTGCAAGATTCTTGTCGGACATTTGTGGGGCTCAGCATAGGCTTGTCATTGACAAAAGACTCTGACATGCACGTGCCGGCACACAGCAGTCCCAGTGACATGTGTGTGCTGCTGCAGTTGTGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于包括： 1）3条上游引物和3条下游引物； 2）阳性对照重组质粒模板； 3）PCR反应液；其中，所述的3条上游引物和3条下游引物序列分别为：扩增褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nl‑F: 5’‑ CAACTAGGTAAGTAAAGGTGCTAC ‑3’Nl‑R: 5’‑ GCTTGCTGTTAAGTCACAAG ‑3’扩增拟褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nb‑F: 5’‑ GCTAGTCATTACATTGTATGTTGG ‑3’Nb‑R: 5’‑ ACTTTCTGGTCCGACTAACAT ‑3’扩增伪褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nm‑F: 5’‑ TGTATGATGGCAGCATTAATCT ‑3’Nm‑R: 5’‑ GAAATTTGTATGGTTCAATGTGTAG ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于包括：1）3条上游引物和3条下游引物；2）阳性对照重组质粒模板；3）PCR反应液；其中，所述的3条上游引物和3条下游引物序列分别为：扩增褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nl-F:5’-CAACTAGGTAAGTAAAGGTGCTAC-3’Nl-R:5’-GCTTGCTGTTAAGTCACAAG-3’扩增拟褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nb-F:5’-GCTAGTCATTACATTGTATGTTGG-3’Nb-R:5’-ACTTTCTGGTCCGACTAACAT-3’扩增伪褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：Nm-F:5’-TGTATGATGGCAGCATTAATCT-3’Nm-R:5’-GAAATTTGTATGGTTCAATGTGTAG-3’。2.如权利要求1所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于其中所述的阳性对照为：分别含褐飞虱ITS1、拟褐飞虱ITS1、伪褐飞虱IST2区核苷酸序列的重组质粒标准品。3.如权利要求1所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液的成分为：2×扩增缓冲液Mix，5μL；10μΜ/L引物，Nl-F和Nl-R各0.15μL、Nb-F和Nb-R各0.12μL、Nm-F和Nm-R各0.20μL；待测样品粗组织液，1μL；1.0U/μLTaqpolymerase，0.2μL；ddH2O，补足10μL。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑华，唐健，刘瑞，罗举，王爱英，杨保军，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33