一种新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种新型非病毒阳离子型基因载体及其制备方法。首先使用氧阴离子聚合方法合成聚阳离子型电解质和含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物，然后，通过静电力作用使聚阳离子型电解质与ＤＮＡ在ｐＨ７．４的盐溶液或缓冲溶液中相互复合，实现聚阳离子型电解质对ＤＮＡ的包裹，且形成的“ＤＮＡ／聚阳离子”复合物，其表面带正电荷，向体系中加入含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物ＭｅＰＥＯ－ｂ－ＰＭＡＡ，通过静电力作用与氢键作用使带负电荷的ＰＭＡＡ链段吸附在“ＤＮＡ／聚阳离子”复合物表面，实现对复合物的包裹。本发明专利技术具有聚合反应条件温和、分子量可控以及分子量分布窄、基因载体制备方法简单、稳定性和生物相容性高、毒性低等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医用髙分子材料
，具体涉及一种新型非病毒阳离 子型基因载体的制备方法。
技术介绍
基因治疗是一种对各种与基因相关、威胁到人类生命的疾病有重要潜在治 疗作用的一种新的治疗方法。基因治疗在四十多年的发展道路上取得了很多惊 人的成就，也遇到了很多困难。基因治疗要真正进入临床应用，还有一些根本 问题没有解决，其中最重要的是安全、髙效及可控的基因载体的构建。目前基因治疗领域主要有三种不同的基因输送体系(1)物理转染技术体 系，如电穿孔和粒子轰击技术等，它们的使用一般局限于体表组织，并有一定 的损伤，裸DNA注射的转染效率相对较低。(2)病毒载体，包括反转录病毒， 腺体病毒和腺体相关病毒等，已在体外实验中显示了较髙的转导效率；然而， 病毒载体大多需要保留野生病毒的外壳和感染机制，在安全性方面存在某些隐 患，如对载体外壳的免疫反应，基因随机整合的致癌性和潜在内源病毒重组等 问题；同时，病毒载体缺乏体内的靶向机制，可控性比较差，如在肿瘤基因治 疗中，病毒载体肿瘤基因治疗方案主要针对一些身体浅表可及的肿瘤，如皮肤 癌，头颈部肿瘤等，进行瘤内或瘤周注射。(3)非病毒载体，主要依靠带正电 荷的聚合物(如阳离子聚合物，带正电荷的脂质体等)将DNA包载成一定大 小的DNA复合物进行传输。与病毒载体相比，利用非病毒载体进行DNA输送 有许多优点对受转移的DNA大小和数目没有限制；制备相对简单；低毒性； 不发生外源基因随机整合；免疫原性问题较小以及安全性较髙等。更重要的是 在非病毒载体中可以根据具体应用设计相应的靶向作用机制，有效地降低毒副 作用，提高作用效率。研究发现一些阳离子聚合物能将DNA包载成一定大小 的DNA复合物，并帮助DNA转染(Miller， A. D" Angew. Chem., Int. Ed. 1998,37， 1768)，如聚赖氨酸(polylysine)，聚乙烯基亚胺(polyethylenimine),聚氨 基胺树型髙分子(PAMAM dendrimer)，等等。阳离子聚合物已广泛应用在体外基因传输中，例如公开号为CN101024090A 的中国专利技术专利申请《一种基因传递复合物及其制备方法》，公开了一种由细 菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的基因传递复合物；公开号为 CN1757738A的中国专利技术专利《双靶向于成纤维细胞生长因子受体和整合素的 转基因载体》，公开了一种双靶向于成纤维细胞生长因子受体和整合素的转基 因载体，包括与碱性成纤维细胞生长因子受体特异结合的多肽CR16、与整合 素特异结合的多肽CP9、 CR16/CP9/阳离子多聚物PEI/外源DNA的基因转移 非病毒载体复合物系统；公开号为CN101085356A的中国专利技术专利申请《一种 非病毒基因转染载体、其与质粒DNA复合物颗粒及制备方法和用法》提供了 一种含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物作为非病毒基因转染载 体。虽然有关阳离子聚合物与DNA相互作用形成DNA复合物的过程以及DNA 复合物的物化性质的研究受到了很大重视，也有不少的报道，但是目前常用的 阳离子聚合物作为基因载体的一个很大的局限性在于聚合物分子的大小和价 态的非均一性，这种非均一性直接导致所制备的载体组成和结构的不同，给生 物体内的释放研究带来巨大的困难。此外，由于非病毒载体/DNA复合物的体内输送最主要的方式是血液传输， 因此，必须制备在血液中稳定、在体内能长时间循环的基因输送载体，将载体 包载的DNA复合物通过静脉给药的方式，将治疗基因靶向输送到特定的组织 和细胞中。为了解决复合物稳定性与相容性问题，文献报道了大量的方法，主 要包括两大类方式 一、聚合物的化学修饰，以甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(PDMAEMA )为例DMAEMA (Biomacromolecules 2003， 4 , 683)， PDMAEMA-co-PMMA， PDMAEMA-co-PtriEGMA, PDMAEMA-co-PNVP (J. Control. Release. 1998,53,145) ， PDMAEMA-6-POEGMA， PDMAEMA瞬6-PEG， PDMAEMA-"fl,-PEGMA (J. Control. Release. 2001， 73, 359; Langmuir 2006， 22， 3744)， PDMAEMA-6-PMPC (Langmuir 2005， 21， 3591; J.Control. Release. 2004， 100， 293)， PDMAEMA-6-Pluronic L92 (Bioconjugate Chem. 2005， 16， 626)，上述聚合物的合成多采用活性聚合的方法，如最常用的是采用ATRP引发体系，虽然分子量以及分子量分布得到了控制，但是存在反应后体系的金属 盐类难以除去以及合成难度较大等问题。二、复合物的包埋方法，包埋方法主 要通过以下方式进行首先聚阳离子聚合物与DNA形成复合物，然后使用阴 性或中性的脂质体对其包裹。这种包埋的方法简单，解决了生物体的相容性问 题，但同时体外细胞转染表明，它的转染效率却有所降低。因此，结合聚合物的化学后修饰与脂质体包埋两种方法的优点，设计出一 种合成方法简单、包载容易、生物相容性好、转染效率高的基因载体，将有助 于推动基因治疗的发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种新型非病毒阳离子型基因载体及其制备方法， 以及利用基因载体负载DNA的技术方案。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是 一种新型非病毒基因载体的 制备方法，具体包括以下步骤(1) 采用氧阴离子聚合法合成聚阳离子型电解质，即端基为生物基团的聚 甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯；(2) 采用氧阴离子聚合法合成含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物，即聚乙 二醇单甲醚与聚甲基丙烯酸的嵌段共聚物MePEO-6-PMAA;(3) 将步骤(1)所得聚阳离子型电介质溶解于pH 7.4的缓冲溶液中，超声分 散，缓慢滴加DNA水溶液，搅拌2小时以上，实现聚阳离子对DNA的包裹， 形成DNA/聚阳离子复合物溶液，该步骤中聚阳离子型电介质中的N原子个 数与DNA中P原子个数比为4:1 10:1;(4) 将步骤(2)所得MePEO-6-PMAA共聚物溶解于pH 7.4的缓冲的溶液 中，超声分散，缓慢滴加到步骤(3)所得DNA/聚阳离子复合物溶液中，搅拌2 小时以上，实现聚阴离子PMAA链段对DNA/聚阳离子复合物的包裹，该步 骤中聚阴离子PMAA链段中羧基的数目与聚阳离子中氮原子的数目比为 1:1 6:1。本专利技术中所述的聚阳离子型电解质由下列通式表达<formula>formula see original document page 8</formula>式中，n为10 120; Rbi。—OH选自即(1)维生素A" (2)维生素A2; (3)维生素D3; (4)胆固醇 (5)维生素D2; (6)橙花油醇； (7)薄荷醇；Ri选自"3 ,H2CH3 /CH(CH3)2—N\ —N\ —N^ 中的一种。CH3 CH2CH3 CH(CH3)2为了合成上述聚阳离子电解质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：　　　　（１）采用氧阴离子聚合法合成聚阳离子型电解质，即端基为生物基团的聚甲基丙烯酸－２－（烷基取代的氨基）乙酯；　　　　（２）采用氧阴离子聚合法合成含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物，即聚乙二醇单甲醚与聚甲基丙烯酸的嵌段共聚物ＭｅＰＥＯ－ｂ－ＰＭＡＡ；　　　　（３）将步骤（１）所得聚阳离子型电介质溶解于ｐＨ７．４的缓冲溶液中，超声分散，缓慢滴加ＤＮＡ水溶液，搅拌２小时以上，实现聚阳离子对ＤＮＡ的包裹，形成ＤＮＡ／聚阳离子复合物溶液，该步骤中聚阳离子型电介质中的Ｎ原子个数与ＤＮＡ中Ｐ原子个数比为４∶１～１０∶１；　　　　（４）将步骤（２）所得ＭｅＰＥＯ－ｂ－ＰＭＡＡ共聚物溶解于ｐＨ７．４的缓冲溶液中，超声分散，缓慢滴加到步骤（３）所制得的ＤＮＡ／聚阳离子复合物溶液中，搅拌２小时以上，实现聚阴离子ＰＭＡＡ链段对ＤＮＡ／聚阳离子复合物的包裹，该步骤中聚阴离子ＰＭＡＡ链段中羧基的数目与聚阳离子中氮原子的数目比为１∶１～６∶１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾子旭，倪沛红，袁媛，何金林，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]