一种禽腺病毒纸片载体潮汐式悬浮培养方法技术

本发明专利技术涉及病毒扩增生物技术领域，具体公开了一种血清型为I群‑4型的禽腺病毒的纸片载体潮汐式悬浮培养扩增方法。具体为将血清型为I群‑4型的禽腺病毒接种于鸡肝癌细胞，通过细胞纸片载体悬浮培养技术高效扩增血清型为I群‑4型禽腺病毒。本发明专利技术首次针对血清型为I型‑4型的禽腺病毒提出纸片载体悬浮培养扩增方法。通过优化细胞培养液的成分和潮汐式生物反应器的培养参数，提高所获病毒的效价。

【技术实现步骤摘要】
一种禽腺病毒纸片载体潮汐式悬浮培养方法
本专利技术涉及病毒扩增生物
，具体地说，涉及一种血清型为I群-4型禽腺病毒纸片载体潮汐式悬浮培养扩增方法。
技术介绍
禽腺病毒，属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5种(A-E)，12个血清型FADV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2014年起，国内鸡群由FADV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015-2016年，FADV感染在国内多个省份鸡群暴发。目前FADV暴发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性I群-4型在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对血清型为I群-4型的商品化疫苗；在疫苗的研制中，普通细胞培养很难满足疫苗的规模化生产要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种血清型为I群-4型的禽腺病毒纸片载体悬浮培养扩增方法。本专利技术的原理和最核心的关键技术是利用鸡肝癌细胞，通过激流潮汐式生物反应器纸片载体悬浮培养技术高效扩增血清型为I群-4型禽腺病毒，所培养的4型FADV病毒滴度符合要求，且满足大规模生产的需求。实现本专利技术的技术解决方案是通过提取所述血清型为I群-4型禽腺病毒基因组DNA，以其病毒DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，后将病毒接种于鸡肝癌细胞，通过细胞纸片载体悬浮培养技术高效扩增血清型为I群-4型禽腺病毒。本专利技术一种血清型为I群-4型禽腺病毒纸片载体悬浮培养扩增方法，具体包括如下步骤：禽腺病毒分离鉴定：无菌采集疑似包涵体肝炎病鸡的肝脏，研碎后用按1：3的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融三次后，4000r/min离10min，取上清；加入青霉素和链霉素各10000IU/mL，4℃过夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后作为临床样品-70℃保存备用。将上述制备的病毒液以0.2mL/胚的剂量，经卵黄囊途径接种5～7日龄SPF鸡胚原始组织毒和10倍稀释组织毒，37℃孵育，湿度60％，每日观察2次，连续观察7d；弃24h内死胚，收获24～168小时内的鸡胚尿囊液及鸡胚肝脏，7天未死亡胚，同样也收获尿囊液及鸡胚肝脏，记为LLF1。用上述方法处理后续传2代，观察第三代死胚的肝组织，并收集尿囊液及鸡胚肝脏-70℃保存备用。取5只已长成良好LMH细胞单层的T-25细胞培养瓶，弃去生长液，用DMEM高糖培养基洗涤3次，分别加入临床样品，按2％量接毒，37℃吸附60分钟，每瓶加入细胞维持液5毫升，37℃培养。每日两次观察细胞病变情况，待细胞病变超过80％时，收获细胞维持液，测定TCID50，记为FF1病毒液。按照上述方法进行LMH细胞接种培养，一次接种10瓶已长成良好LMH细胞单层的T-25细胞培养瓶，连续传代培养2代，分别记为FF2至FF3病毒液，病毒液置于-70℃保存备用。按照DNeasyBlood&TissueKit(QINGEN)的说明书操作方法提取细胞传代病毒的DNA，于-20℃保存备用。引物设计：PCR反应：用扩增性能优良的LA(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书配制50μL反应体系，扩增条件为：94℃3min，94℃30s，57℃30s，72℃1min30s，35个循环后，72℃10min，纯化收回PCR产物。将纯化回收的产物送武汉生工测序。分析确定为血清型为I群-4型禽腺病毒。血清型为I群-4型禽腺病毒纸片载体悬浮培养将病毒接种于鸡肝癌细胞，利用激流潮汐式生物反应器扩增血清型为I群-4型禽腺病毒。所述培养方法具体包括如下步骤：(1)将鸡肝癌细胞接种到纸片载体上，倒置静止吸附1-2h；初始细胞接种数为：1×108个/5.5gBioNOCII纸片载体；(2)利用潮汐式生物反应器扩增鸡肝癌细胞，培养条件参数为：UPRATE：1.0mm/sT-HTIME：40s；DOWNRATE：1.0mm/sB-HTIME：10s；细胞培养液为含5％FBS血清+5％NBS血清的DMEM高糖完全培养基，pH为7.2-7.4；(3)当鸡肝癌细胞的细胞数达到4.5-4.8×108个时，排出潮汐式生物反应器中的细胞培养液，加入pH为7.2-7.4的无血清DMEM高糖培养液作为细胞维持液；设置培养条件参数为：UPRATE：2.0mm/sT-HTIME：0s；DOWNRATE：2.0mm/sB-HTIME：0s；反应5min，PBS溶液洗3次；(4)然后按照每100ml细胞维持液接毒5ml的接毒量接毒，静止倒置吸附1-2h后，设置培养条件参数为：UPRATE：1.0mm/sT-HTIME：40s；DOWNRATE：1.0mm/sB-HTIME：10s；开始潮汐式培养；培养96h后收集细胞数降为1.5-2.0×108个细胞，糖值消耗不变的病毒液，冻融，收集病毒液，分装，检测TCID50。结果显示通过纸片载体悬浮培养扩增的三批血清型为I群-4型的禽腺病毒效价分别为TCID50/0.2ml≥107.0；TCID50/0.2ml≥106.8；TCID50/0.2ml≥107.2。进一步地，作为优选，鸡肝癌细胞接种病毒后，每隔24h取样测糖耗，当残糖量低于3.0g/L，进行换液(无血清DMEM高糖培养液)。本专利技术涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次针对血清型为I型-4型的禽腺病毒提出纸片载体悬浮培养扩增方法。通过优化细胞培养液的成分和潮汐式生物反应器的培养参数，提高所获病毒的效价。附图说明图1为本专利技术PCR扩增产物血清型为I型-4型禽腺病毒测序基因树。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1血清型为I群-4型禽腺病毒通过纸片载体悬浮培养将病毒接种于鸡肝癌细胞，利用激流潮汐式生物反应器扩增血清型为I群-4型禽腺病毒。BelloStage-3000悬浮培养潮汐式生物反应器主要培养条件及参数为：(1)将鸡肝癌细胞接种到纸片载体上，倒置静止吸附1-2h；初始细胞接种数为：1×108个/5.5gBioNOCII纸片载体；(2)利用潮汐式生物反应器扩增鸡肝癌细胞，培养条件参数为：UPRATE：1.0mm/sT-HTIME：40s；DOWNRATE：1.0mm/sB-HTIME：10s；细胞培养液为含5％FBS血清+5％NBS血清的DMEM高糖完全培养基，pH为7.2-7.4；(3)当鸡肝癌细胞的细胞数达到4.5-4.8×108个时，排出潮汐式生物反应器中的细胞培养液，加入pH为7.2-7.4的无血清DMEM高糖培养液作为细胞维持液；设置培养条件参数为：UPRATE：2.0mm/sT-HTIME：0s；DOWNRATE：2.0mm/sB-HTIME：0s；反应5min，PBS溶液洗3次；(4)然后按照每100ml细胞维持液接毒5ml的接毒量接毒，静止倒置吸附1-2h后，设置培养条本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽腺病毒纸片载体潮汐式悬浮培养方法，其特征在于，将血清型为I群‑4型的禽腺病毒接种于鸡肝癌细胞，通过细胞纸片载体悬浮培养技术高效扩增血清型为I群‑4型禽腺病毒。

【技术特征摘要】
1.一种禽腺病毒纸片载体潮汐式悬浮培养方法，其特征在于，将血清型为I群-4型的禽腺病毒接种于鸡肝癌细胞，通过细胞纸片载体悬浮培养技术高效扩增血清型为I群-4型禽腺病毒。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用BelloStage-3000潮汐式生物反应器实现禽腺病毒的细胞纸片载体悬浮培养；所述培养方法具体包括如下步骤：(1)将鸡肝癌细胞接种到纸片载体上，倒置静止吸附1-2h；初始细胞接种数为：1×108个/5.5gBioNOCII纸片载体；(2)利用潮汐式生物反应器扩增鸡肝癌细胞，培养条件参数为：UPRATE：1.0mm/sT-HTIME：40s；DOWNRATE：1.0mm/sB-HTIME：10s；细胞培养液为含5％FBS血清+5％NBS血清的DMEM高糖完全培养基，pH为7.2-7.4；(3)当鸡肝癌细胞的细胞数...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳建新，袁野，周蕾蕾，陈秋阁，张贺楠，孙灵睿，李爱君，李浩鹏，张秀美，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11