有关病毒的无菌纯化方法技术

本文描述了用于纯化病毒的方法及其组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】有关病毒的无菌纯化方法
本公开涉及用于纯化病毒的方法。专利技术背景管理机构，如世界卫生组织(WorldHealthOrganization)建立了有关制造如疫苗等施用给人类的药物组合物的标准和指导原则，其中限制了这些组合物的量和成分。例如，对于疫苗来说，有疫苗制剂必须是无菌的(即，不含独立复制的生物体)并且含有每次人用剂量不超过10ngDNA等要求。为了确保供人类施用的组合物的安全性，这些标准应当遵守，而且可能在用于制造这些组合物的方法中带来挑战。专利技术概要本专利技术各方面提供了用于纯化病毒颗粒的方法，这些方法包括以下步骤：(a)提供含病毒颗粒的液体培养基，其中所述病毒颗粒的直径大于约100nm；(b)使所述病毒颗粒与固相基质接触，该固相基质包括配体活化的核及包含孔无活性壳，其中所述孔的分子量截留值阻止所述病毒颗粒进入所述配体活化的核中，并且其中小于所述孔的分子量截留值的分子能够进入所述配体活化的核中；及(c)通过过滤将所述固相基质与所述病毒颗粒分离以得到最终病毒制剂；其中所述方法是在无菌下执行。在一些实施方案中，含病毒颗粒的液体培养基在步骤(b)之前经历一个或多个预纯化步骤。在一些实施方案中，预纯化步骤包括(a)通过酶处理来消化含多个病毒或病毒颗粒的液体培养基中的宿主细胞基因组DNA；和/或(b)使用孔径等于或大于750kDa的中空纤维膜对含多个病毒或病毒颗粒的液体培养基进行超滤/透滤。在一些实施方案中，病毒颗粒的直径是约200nm、300nm、400nm、500nm或更大。在一些实施方案中，病毒是活病毒、减毒活病毒、修饰的活病毒或重组活病毒。在一些实施方案中，病毒属于选自由以下组成的组的病毒科：副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)及冠状病毒科(Coronaviridae)。在一些实施方案中，病毒属于副粘病毒科(活病毒或灭活病毒)。在一些实施方案中，病毒是麻疹病毒。在一些实施方案中，进入固相基质的核中的分子具有小于700kDa的分子量。在一些实施方案中，固相基质中配体活化的核的配体能够通过阳离子相互作用、阴离子相互作用、疏水相互作用或混合相互作用结合进入该配体活化的核中的分子。在一些实施方案中，固相基质中配体活化的核的配体是辛胺。在一些实施方案中，固相基质是以浆液形式使用并且最终浓度介于2.5％(v/v)与30％(v/v)之间，优选是3.3％、5％、6.6％或10％，最优选是10％。在一些实施方案中，在搅拌下，在室温(20℃至25℃)下将固相基质与含病毒颗粒的液体培养基一起温育至少1小时，优选2小时、3小时或4小时，最优选2小时。在一些实施方案中，相对于含多个病毒或病毒颗粒的液体培养基，最终病毒制剂的杂质相对减少60至95％。在一些实施方案中，最终病毒制剂的残留杂质小于1％。在一些实施方案中，权利要求1中步骤(c)的过滤是使用孔径等于或大于1μm的过滤器进行。在一些实施方案中，在所述方法之后是一个或多个无菌过滤步骤。在一些实施方案中，病毒是在选自由以下组成组的细胞系中繁殖：EB66细胞系、Vero细胞系、Vero-αHis细胞系、HeLa细胞系、HeLa-S3细胞系、293细胞系、PC12细胞系、CHO细胞系、3T3细胞系、PerC6细胞系、MDSK细胞系、鸡胚成纤维细胞系、鸭细胞系及二倍体禽类细胞系。在一些实施方案中，所述细胞系是鸭细胞系。在一些实施方案中，所述细胞系是二倍体禽类细胞系。在一些实施方案中，所述细胞系是EB66细胞系。本专利技术各方面提供了任何本文所描述的方法的用途，这些方法用于制造供针对病毒感染免疫的组合物。其它方面提供了包含通过本文所描述的任何方法可获得的病毒颗粒的组合物，这些组合物用于治疗和/或预防病毒感染。附图简述预期附图未按比例绘制。各图只是说明性的，而且并非实现本公开所需的。为清楚起见，在每个图中可能未标出每一成分。在附图中：图1显示了麻疹病毒纯化方法的概述。图2显示了在不同纯化步骤时麻疹病毒的尺寸排阻色谱法(SEC)迹线。插图显示麻疹病毒(左侧峰)和杂质(右侧峰)的SEC迹线。图3A-3B显示在纯化过程各阶段期间样品中宿主细胞蛋白质(HCP)的存在情况。图3A显示了代表性银染色的SDS-PAGE凝胶。图3B显示了使用抗EB66-HCP-IgG一次抗体的代表性Western印迹。图4A-4C显示了在透滤和处理后样品中HCP存在的监测情况。图4A显示了代表性银染色的SDS-PAGE凝胶。图4B显示了使用抗EB66-HCP-IgG一次抗体的代表性Western印迹。图4C显示了使用抗麻疹病毒融合蛋白一次抗体的代表性Western印迹。图5A和5B呈现了在纯化过程期间麻疹病毒的纳米颗粒跟踪分析(NTA)。图5A显示来自麻疹病毒采集物的样品的NTA。图5B显示经过透滤的样品的NTA。图6显示了来自麻疹病毒采集物(MV-GFP)的样品的尺寸排阻色谱图(荧光信号和UV214nm；右图)及由多角度静态光散射(MALS)测定的病毒尺寸(左图)。图7显示了高度纯化的麻疹病毒(MV-GFP)样品的尺寸排阻色谱图(荧光信号和UV214nm)及由多角度静态光散射(MALS)测定的病毒尺寸(插图)。图8呈现了在超滤/透滤以减少病毒制剂中的杂质之后间歇吸附的流程图。图9显示了预先灭菌的加工组件的示意图。图10呈现了在使用Core700树脂或Core700与QSFF树脂的组合或Core700与羟磷灰石(Hyx)树脂的组合进行间歇吸附之后，由尺寸排阻色谱法评估的病毒(MVGFP回收率；带条纹)和杂质(实心灰色)的回收率百分比。图11呈现了在使用Core700树脂进行间歇吸附之后，由尺寸排阻色谱法评估的在不同浆液浓度(33％v/v-2.5％v/v)下病毒(MVGFP回收率；带条纹)和杂质(实心灰色)的回收率百分比。图12显示了由尺寸排阻色谱法评估的间歇吸收样品中病毒(MV主峰回收率；菱形)和残留杂质(残余物回收率；正方形)的回收率百分比。图13显示了经间歇吸附加工的样品中的残留杂质相对于未经过间歇吸附的样品相对减少。图14呈现了经Core700间歇吸附(菱形)或未经过间歇吸附(正方形)加工的样品中MV-GFP的总产率。图15显示了由尺寸排阻色谱法评估的在纯化过程期间的各个阶段经Core700间歇吸附(菱形)或未经过间歇吸附(正方形)加工的样品中MV-GFP的纯度。图16显示了由SDS-PAGE凝胶评估的在纯化过程期间的各个阶段经Core700间歇吸附(“存在CC700”)或未经过间歇吸附(“无CC700”)加工的样品中MV-GFP的纯度。图17显示了由尺寸排阻色谱法评估的在纯化过程期间的各个阶段经Core700间歇吸附(菱形)或未经过间歇吸附(正方形)加工的样品中的残留杂质百分比。图18呈现的示意图显示了各种病毒科的分类和特性(http：//www.nlv.ch/Virologytutorials/Classification.htm)。专利技术详述本文公开了用于纯化病毒的无菌方法及包含纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化病毒颗粒的方法，包括以下步骤：(a)提供含病毒颗粒的液体培养基，其中所述病毒颗粒的直径大于约100nm；(b)使所述病毒颗粒与固相基质接触，所述固相基质包括配体活化的核及包含孔无活性壳，其中所述孔的分子量截留值阻止所述病毒颗粒进入所述配体活化的核中，并且其中小于所述孔的分子量截留值的分子能够进入所述配体活化的核中；及(c)通过过滤将所述固相基质与所述病毒颗粒分离，以得到最终病毒制剂；其中所述方法是在无菌下执行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.03 EP 15248012.51.一种纯化病毒颗粒的方法，包括以下步骤：(a)提供含病毒颗粒的液体培养基，其中所述病毒颗粒的直径大于约100nm；(b)使所述病毒颗粒与固相基质接触，所述固相基质包括配体活化的核及包含孔无活性壳，其中所述孔的分子量截留值阻止所述病毒颗粒进入所述配体活化的核中，并且其中小于所述孔的分子量截留值的分子能够进入所述配体活化的核中；及(c)通过过滤将所述固相基质与所述病毒颗粒分离，以得到最终病毒制剂；其中所述方法是在无菌下执行。2.如权利要求1所述的方法，其中含所述病毒颗粒的所述液体培养基在步骤(b)之前经历一个或多个预纯化步骤。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒颗粒的直径是约200nm、300nm、400nm、500nm或更大。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中进入所述固相基质的所述核的分子具有小于700kDa的分子量。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述固相基质的所述配体活化的核的配体能够通过阳离子相互作用、阴离子相互作用、疏水相互作用或混合相互作用结合进入所述配体活化的核中的分子。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述固相基质的所述配体活化的核的配体是辛胺。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述固相基质是以浆液形式使用并且最终浓度介于2.5％(v/v)与30％(v/v)之间，优选是3.3％、5％、6.6％或10％，最优选是10％。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中搅拌下，在室温(20℃至25℃)下将所述固相基质与含所述病毒颗粒的所述液体培养基一起温育至少1小时，优选2小时、3小时或4小时，最优选2小时。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中相对于含多个所述病毒或病毒颗粒的所述液体培养基，所述最终病毒制剂的杂质相对减少60至95％。10.如权利要求1至9中...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·施勒格尔，迈克尔·韦伯，
申请(专利权)人：瓦尔尼瓦公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR