从AAV制剂中去除污染病毒制造技术

本发明专利技术涉及将形状基本为球形的病毒从样品中包含的形状为杆状的病毒分离，其中对包含所述病毒的样品进行过滤。

【技术实现步骤摘要】
从AAV制剂中去除污染病毒本申请为分案申请，其原申请的申请日为2012年9月7日，申请号为201280049899.5，名称为“从AAV制剂中去除污染病毒”。
本专利技术涉及病毒学和基因治疗的领域。具体地，本专利技术涉及一种将形状为杆状的污染病毒(例如杆状病毒)从形状基本为球形的病毒(例如腺伴随病毒基因治疗载体)的制剂中去除的方法。
技术介绍
在产生用于基因治疗的病毒载体中，由于安全性的缘故而使用复制缺陷型病毒。复制缺陷型病毒能够在体内感染人细胞并将转基因转移到所述细胞中，但其不能在所述细胞中自行复制。通常，这可以通过删除对病毒复制很重要的病毒基因例如rep和cap基因来完成。这还使得能够纳入目的基因产物来替换病毒基因。为了在宿主细胞内生成病毒颗粒，需要单独提供从所述复制缺陷型病毒中删除的病毒基因，例如通过提供辅助病毒。腺伴随病毒(AAV)是非自主复制的病毒，其属于细小病毒科，构成外面有直径为约18-26nm的二十面体结构蛋白外壳的单链DNA分子。野生型AAV病毒可以整合到宿主细胞的基因组中，或者在辅助病毒的存在下在宿主细胞中复制。腺病毒最先被鉴定为可能的辅助病毒。然而，其他对人和动物有致病性的基本为球形的哺乳动物辅助病毒例如疱疹病毒也是适合的。最近这些年，在昆虫细胞中借助于基于杆状病毒的表达系统产生腺伴随病毒(AAV)载体(Urabeetal.[2002]HumGeneTher.13(16):1935-43)已经日益普遍，这是因为可以容易地放大所述系统的规模，用于基因治疗的工业应用。在该生成系统中，通常使用编码AAVrep基因、AAVcap基因和侧翼有AAV末端反向重复(ITR)的目的基因产物(转基因DNA)的三种重组杆状病毒。与使用辅助病毒或基于病毒的表达系统进行的病毒载体制备相关的显著缺点是形成产物病毒颗粒与辅助病毒的混合群，所述混合群必须要进行进一步纯化。由于污染病毒例如腺病毒或杆状病毒的潜在致病性和/或免疫原性，因此当在基因治疗中使用病毒载体时，必须要避免存在所述病毒或使其减到最少。一些除去辅助病毒的方法目前是本领域已知的，然而，它们都各有缺点。这些方法的实例为密度梯度离心或热灭活或其结合。然而，密度梯度离心仅对于相对小的体积是经济上可行的，因此该方法对于工业规模是不可行的。热灭活基于AAV和辅助病毒的热稳定性不同。例如，将腺病毒和AAV的混合群加热到56-65℃，可导致大致上选择性地热灭活所述辅助病毒，而AAV的活性仅有轻微的损失。不幸的是，在样品中仍存在的变性的辅助病毒蛋白，一旦在基因治疗中使用，就能够在患者中引起细胞免疫应答(Smith,C.A.etal.(1996)J.Virol.,70,6733-6740)。另外，已经发展了柱色谱方法(包括离子交换色谱(基于阴离子和/或阳离子)和亲和色谱)用于纯化AAV载体。这些方法可导致高度富集的AAV载体制剂，但是不能单独地确认它们表现出足以满足销售的医药产品的监管要求的辅助病毒耗尽。最后，在美国专利6,479,273中公开了通过使含有重组的AAV和腺病毒(即，两种基本为球形而直径相当不同的病毒)的溶液一次或多次过滤通过孔径为约50nm的滤膜或孔径为约35nm的滤膜，来实现两种病毒的分离。据公开rAAV具有约25nm的直径，而腺病毒可以说是具有约65-90nm的直径，但更大的直径例如接近100nm已经在文献[KennedyandParks(2009)MolecularTherapy17(10):1664-1666；Berkowitz(2003)WCBP7thannualmeetingJanuary7-102003,SanFrancisco,CA]中有报道。然而，污染病毒是在昆虫细胞中借助基于杆状病毒表达系统来生成AAV载体的过程中所产生的，其衍生自所述杆状病毒(baculoviridae)，因此是杆状的，长度为约260nm，直径为约20nm。因为(重组的)AAV是基本为球形的，直径为约18-26nm，因此所述杆状病毒部分地(在两个维度中)具有与所述靶病毒相似的大小。监管要求，例如由欧洲药品管理局(EuropeanMedicineAgency，EMA)对衍生自人或动物来源的细胞系的生物技术产品进行的病毒安全评价(ICHQ5A(R1))，要求生物制药的纯化过程能够去除任何非产品的病毒。去除病毒污染物是通过“病毒清除”或“病毒去除”工艺步骤来进行的，通常通过色谱和/或病毒过滤实现。同样，“病毒灭活”工艺步骤用于减弱潜在的由非产物病毒引起的致病效应。这通常含有极端的物理条件(例如pH、温度)和/或化学条件(例如去污剂、溶剂)。药物产品通常为小于约200kDa的蛋白质，并且“病毒去除”方法很完善。然而，相对新型的产品涉及包含大小为几千kDa的病毒的基因治疗产品，对于该产品“病毒去除”方法还未有据可查。具体地，其中药物产品是球形病毒而病毒污染物是杆状病毒的“病毒去除”方法尚未有记载。因此，本领域需要另外的分离/纯化方法，以工业规模应用所述方法在技术上和经济上是可行的，并且所述方法能够从含有AAV的样品(优选获得自基于杆状病毒的表达系统的重组AAV样品)中部分或完全去除基于病毒的表达系统中的非产物病毒。从而降低非产物病毒的潜在致病性和/或免疫原性。具体地，本领域需要另外的分离/纯化方法，其中所述非产物病毒的形状为杆状，其长度是AAV直径的几倍，而直径与所述AAV相似。
技术实现思路
专利技术的简要说明在第一方面，本专利技术涉及将细小病毒病毒体群与杆状病毒病毒体群分离的方法，其中所述方法包括在过滤器上过滤包含细小病毒和杆状病毒病毒体的群的样品的步骤，只有所述细小病毒病毒体可以通过所述过滤器。优选地，所述过滤器的额定孔径为30-70nm，更优选30-40nm，又更优选32-38nm，最优选(约)35nm。在优选的实施方案中，所述细小病毒为腺伴随病毒，更优选所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾多衣壳核型多角体病毒(Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus，AcmNPV)。在优选的实施方案中，在样品过滤过程中使用的过滤器是病毒过滤器或超滤器。优选地，所述过滤器为表面式过滤器(surfacefilter)和/或深度式过滤器(depthfilter)。本专利技术的方法中使用的过滤器优选包含选自如下的材料：铜铵再生纤维素、聚偏二氟乙烯、聚砜(例如聚醚砜，例如修饰的或未修饰的聚醚砜)、聚四氟乙烯、聚丙烯、修饰的或未修饰的聚醚砜、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺或再生纤维素。在特别优选的实施方案中，本专利技术的方法中使用的过滤器包含铜铵再生纤维素，优选铜铵再生纤维素中空纤维，更优选其中所述过滤器是PlanovaTM35膜(AsahiKASEI；www.planovafilters.com)。在另一优选的实施方案中，本专利技术的方法中使用的过滤器为UltiporTMVF级DV50病毒去除过滤器(PallCorp.；www.pall.com)。在本专利技术方法的实施方案中，使用两个或多个过滤器过滤所述样品。在本专利技术的方法中，所述样品可在过滤步骤之前使用选自如下的方法进行预纯化：密度梯度、预过滤、色谱步骤(优选亲和色谱和/或离子交换色谱)，以及这些方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将细小病毒病毒体群从杆状病毒病毒体群分离的方法，其中所述方法包括在正切流动过滤型式中在过滤器上过滤样品的步骤，所述样品包含细小病毒和杆状病毒病毒体的群，其中所述过滤器的额定孔径为30‑70nm。

【技术特征摘要】
2011.09.08 EP 11180594.1;2011.09.08 US 61/532,1761.一种将细小病毒病毒体群从杆状病毒病毒体群分离的方法，其中所述方法包括在正切流动过滤型式中在过滤器上过滤样品的步骤，所述样品包含细小病毒和杆状病毒病毒体的群，其中所述过滤器的额定孔径为30-70nm。2.权利要求1的方法，其中所述样品在过滤步骤之前使用选自如下的方法进行预纯化：密度梯度、预过滤、色谱步骤，以及这些方法的结合，获得预纯化的样品。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述细小病毒为腺伴随病毒。4.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)多衣壳核型多角体病毒(AcmNPV)。5.前述权利要求任一项的方法，其中所述过滤器为病毒过滤器或超滤器。6.前述权利要求任一项的方法，其中所述过滤器为表面式过滤器和/或深度式过滤器。7.前述权利要求任一项的方法，其中所述过滤器包含选自如下的材料：铜铵再生纤维素、聚偏二氟乙烯、聚砜、聚四氟乙烯、聚丙烯、修饰的或未修饰的聚醚砜、乙酸纤维素、硝酸纤维素、硝酸纤维素、...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·T·J·M·C·赫尔门斯，J·P·史密斯，
申请(专利权)人：尤尼克尔IP股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL