一种猪圆环病毒分离方法技术

技术编号:16810275 阅读:59 留言:0更新日期:2017-12-16 06:32
一种猪圆环病毒的分离培养方法,属于兽用生物制品技术领域。其包括以下步骤:病料的采集与处理;小鼠淋巴细胞进行贴壁培养;分离病毒培养。本发明专利技术具有以下有益效果:本发明专利技术所提出的一种猪圆环病毒的分离方法,提供了一种新型病毒分离样品处理液,无需冻融病料,简单快捷,省时省力;提出了一种促病毒繁殖的维持液中,增加了分离病毒的病毒含量;提供一种新的用于猪圆环病毒培养的原代细胞,小鼠淋巴细胞制备简单快速,成本低廉,还大大缩短了病毒的分离周期,有利于猪圆环病毒病的及时诊断和研究。

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒分离方法
本专利技术属于兽用生物制品
,具体涉及一种猪圆环病毒的分离培养方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus-2,PCV-2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的病原,同时还与猪呼吸道综合症(PRDC)、猪皮炎和肾病综合征(PNDS)、先天性震颤、繁殖障碍、胎儿心肌炎和扩张性坏死性肺炎等猪圆环病毒病密切相关,已成为影响世界养猪业的最重要的病毒性传染病。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属,病毒粒子直径为17nm,呈二十面体对称、无囊膜,基因组为单股环状负链DNA,是目前发现的最小的动物病毒。鉴于此,我们将充分利用PCV2粒子直径小,提出一种新的病毒分离方法;PCV2的培养对宿主细胞比较严格,在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞上均不能生长,可在PK-15细胞中生长,但不能引起细胞病变,且需将PCV盲传多代才能使病毒有效增殖,因此发现一种新的细胞的对PCV2的培养尤为重要。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题,本专利技术目的在于设计提供一种猪圆环病毒分离培养方法的技术方案,为猪圆环病毒的诊断及研究提供依据。所述的一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于包括以下步骤:1)无菌采取具有PMWS症状和剖检病变的自然病例的淋巴结、肺脏、脾脏和扁桃体等组织,放置于绞肉机中绞碎,向肉糜中加入肉糜总质量1-5倍的病毒处理液,经胶体磨充分研磨,混合均匀;将得到的混合液置于高压匀质机内,在匀质处理过程中温度控制在27℃以下,即得到匀浆处理液;在匀浆处理液中按1:1-1:2加入病毒处理液,混合均匀,静置10-15min后,进行分装离心,3000-5000r/min,离心5-10min,取上清待用;将得到的上清液过滤处理,收集滤液,即PCV2原液;2)取小鼠淋巴细胞进行贴壁培养;3)取已培养24h贴壁生长良好的小鼠淋巴细胞,弃去细胞培养液,将PCV2原液与维持液按体积比1:10-1:20比例接种至细胞瓶内,同时设PCV2的阳性对照和空白对照组,将细胞瓶置于37℃、5%CO2培养箱中培养96-120h,收集病变明显的细胞液,置于-20℃保存。所述的一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于所述的步骤1)中病毒处理液通过以下步骤制得:取蔗糖1-8g、氯化钾0.5-2g、氯化钠1-5g、芍药苷20-40mg、L-谷氨酸钠0.5-1g、青霉素60-100mg和链霉素60-100mg;将以上各成分混合后,溶于1000ml双蒸水中,并且用0.1M的NaHCO3调PH至8.0-10.0,经0.22um滤膜进行过滤即得,置于4℃保存备用。所述的一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于所述的步骤1)中上清液过滤处理具体为:上清液首先通过0.65-0.1um孔径进行微滤处理,收集微滤液,按1:1-1:5加病毒处理液,将稀释好的微滤液通过孔径300KD-800KD的中空纤维膜微滤系统进行处理,收集滤液,即PCV2原液。所述的一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于所述的步骤2)中小鼠淋巴细胞进行贴壁培养具体为:将BALB/c小鼠断髓处死,无菌分离小鼠双侧领下、腋窝、浅腹股沟及肠系膜淋巴结,200目筛网研磨过滤,收集细胞,用PH7.0-7.4的冷PBS洗涤细胞2次后,用RPMI-1640完全细胞培养基重悬,进行计数并调整细胞浓度为1×105-1×106个/ml,置于37℃、5%CO2的培养箱中分别培养0.5、1、2、6、24h后,更换新培养液,最后剩余细胞均为贴壁细胞。所述的一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于所述的步骤3)中维持液通过以下步骤制得:取D-氨基葡萄糖0.5-10g、三七皂苷1-10g和海藻多糖0.5-5g;将以上各成分混合后,溶于1000mlDMEM,经0.22um滤膜进行过滤即得,置于4℃保存备用。所述的一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于所述的步骤3)中将PCV2原液与维持液按体积比1:12-1:18比例接种至细胞瓶内。本专利技术具有以下有益效果:1、本专利技术所提出的一种猪圆环病毒的分离培养方法,首次提出应用小鼠淋巴细胞进行病毒分离,可以提高病毒的分离成功率;2、本专利技术所提出的一种猪圆环病毒的分离培养方法,充分利用病毒的培养特性,提出了一种促病毒繁殖的维持液中,可以促进病毒的繁殖,缩短病毒的分离时间,还能够增加病毒含量;3、本专利技术所提出的一种猪圆环病毒的分离培养方法,与传统的分离方法相比,无需冻融,机械化程度高,减少在分离过程中污染机会,操作步骤简单、易于操作。附图说明图1为PCV2的PCR鉴定结果;图1中:1-阴性对照;2-阳性对照;3-所分离的毒株;M-DL1000bp。图2为接种病毒的细胞培养物荧光图。图3为正常细胞培养物荧光图。具体实施方式为了使本专利技术更加容易理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本专利技术。应理解,这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围,下列实施例中未提及的具体实验方法,通常按常规实验方法进行。实施例1:病毒处理溶液的配制蔗糖:4g氯化钾:2g氯化钠:3g芍药苷:30mg购买于百灵威科技有限公司)L-谷氨酸钠:0.8g(购买于南京化学试剂股份有限公司)青霉素:80mg链霉素:60mg将以上各成分混合后,溶于1000ml双蒸水中,并且用0.1M的NaHCO3调pH至9.0,经0.22um滤膜进行过滤即得,置于4℃保存备用。该实施例中也可以按蔗糖1g、氯化钾0.5g、氯化钠1g、芍药苷20mg、L-谷氨酸钠0.5g、青霉素60mg和链霉素100mg进行配制,或按蔗糖8g、氯化钾1.5g、氯化钠5g、芍药苷30mg、L-谷氨酸钠1g、青霉素100mg和链霉素80mg进行配制,最后也能达到与实施例1相同的技术效果。实施例2:病料的采集与处理无菌采取具有PMWS症状和剖检病变的自然病例的淋巴结(气管、支气管淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结)、肺脏、脾脏和扁桃体等组织,放置于绞肉机中绞碎,向肉糜中加入肉糜总质量3倍的病毒处理液,经胶体磨充分研磨,混合均匀。将得到的混合液置于高压匀质机内,在匀质处理过程中温度控制在27℃以下,即得到匀浆处理液。在匀浆处理液中按1:2、1:3或1:5加入病毒处理液,混合均匀,静置15min后,进行分装离心,3000、4000或5000r/min,离心8min,取上清待用。将得到的上清液,首先通过0.45um孔径进行微滤处理,收集微滤液,按1:1或1:2加病毒处理液,将稀释好的微滤液通过孔径500KD的中空纤维膜微滤系统(购买于天津膜天膜工程技术有限公司)进行处理,收集滤液,即PCV2原液。实施例3:维持液的配制D-氨基葡萄糖:8g(购买于Sigma)三七皂苷:5g(购买于上海源叶生物科技有限公司)海藻多糖:2g(购买于湖北远成赛创科技有限公司)将以上各成分混合后,溶于1000mlDMEM,经0.22um滤膜进行过滤即得,置于4℃保存备用。该实施例中也可以采用D-氨基葡萄糖0.5g、三七皂苷1g和海藻多糖2g进行配制,或采用D-氨基葡萄糖10g、三七皂苷10g和海藻多糖5g进行配制,最后也能达到与实施例3相同的技术效果。实施例4:小鼠的淋巴细胞制备将BALB/c小鼠断髓处死,无菌分离小鼠双侧领下、腋窝、浅腹股沟及肠系膜淋巴结,200目筛网研磨过本文档来自技高网...
一种猪圆环病毒分离方法

【技术保护点】
一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于包括以下步骤:1)无菌采取具有PMWS症状和剖检病变的自然病例的淋巴结、肺脏、脾脏和扁桃体等组织,放置于绞肉机中绞碎,向肉糜中加入肉糜总质量1‑5倍的病毒处理液,经胶体磨充分研磨,混合均匀;将得到的混合液置于高压匀质机内,在匀质处理过程中温度控制在27℃以下,即得到匀浆处理液;在匀浆处理液中按1:1‑1:2加入病毒处理液,混合均匀,静置10‑15min后,进行分装离心,3000‑5000r/min,离心5‑10min,取上清待用;将得到的上清液过滤处理,收集滤液,即PCV2原液;2)取小鼠淋巴细胞进行贴壁培养;3)取已培养24h贴壁生长良好的小鼠淋巴细胞,弃去细胞培养液,将PCV2原液与维持液按体积比1:10‑1:20比例接种至细胞瓶内,同时设PCV2的阳性对照和空白对照组,将细胞瓶置于37℃、 5%CO2培养箱中培养96‑120h,收集病变明显的细胞液,置于‑20℃保存。

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于包括以下步骤:1)无菌采取具有PMWS症状和剖检病变的自然病例的淋巴结、肺脏、脾脏和扁桃体等组织,放置于绞肉机中绞碎,向肉糜中加入肉糜总质量1-5倍的病毒处理液,经胶体磨充分研磨,混合均匀;将得到的混合液置于高压匀质机内,在匀质处理过程中温度控制在27℃以下,即得到匀浆处理液;在匀浆处理液中按1:1-1:2加入病毒处理液,混合均匀,静置10-15min后,进行分装离心,3000-5000r/min,离心5-10min,取上清待用;将得到的上清液过滤处理,收集滤液,即PCV2原液;2)取小鼠淋巴细胞进行贴壁培养;3)取已培养24h贴壁生长良好的小鼠淋巴细胞,弃去细胞培养液,将PCV2原液与维持液按体积比1:10-1:20比例接种至细胞瓶内,同时设PCV2的阳性对照和空白对照组,将细胞瓶置于37℃、5%CO2培养箱中培养96-120h,收集病变明显的细胞液,置于-20℃保存。2.如权利要求1所述的一种猪圆环病毒分离方法,其特征在于所述的步骤1)中病毒处理液通过以下步骤制得:取蔗糖1-8g、氯化钾0.5-2g、氯化钠1-5g、芍药苷20-40mg、L-谷氨酸钠0.5-1g、青霉素60-100mg和链霉素60-100mg;将以上各成分混合后,溶于1000ml双蒸水中,并且用0.1M的NaHCO3调PH至8.0-10.0,经0.22um滤膜进行...

【专利技术属性】
技术研发人员:张秀文李阳沈建军
申请(专利权)人:浙江美保龙生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:浙江,33

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1