高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用制造技术

高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用，包装质粒和膜囊质粒，所述包装质粒为pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev，囊膜质粒为VSV‑G，用于细胞转染的Buffer A:1M CaCl2，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO3，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基。利用4质粒表达系统共转染HEK 293T细胞，收集病毒上清，超速离心后获得滴度高达10

Preparation kit of high titer lentivirus and its application

Kit for preparation and application of high titer lentiviral packaging plasmid, and membrane vesicles of plasmid, the plasmid pMDLg/pRRE, pRSV packaging Rev capsule for VSV plasmid G, transfected Buffer A:1M cells for CaCl2, 2 * BES, with the most suitable packaging environment B:1M Buffer virus NaHCO3 resuspend virus virus, reduce the adhesion loss of Buffer C:302 serum free medium. The expression of HEK were co transfected into 293T cells using 4 plasmid, the viral supernatant was collected, ultracentrifugation was as high as 10

【技术实现步骤摘要】
高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用
本专利技术涉及高滴度慢病毒的制备及其在高效感染小鼠腹腔巨噬细胞方面的应用。
技术介绍
现有的转基因方法包括物理方法、化学方法和生物学方法。物理方法主要包括DNA显微注射法、电穿孔法和金属颗粒轰击法等；化学方法主要包括脂质体或受体介导的转染等；生物学方法主要指病毒感染。电转、脂质体介导的转染等方法安全性高，但效率较低，且难以实现外源基因的稳定永久表达。腺病毒载体系统感染效率高,但目的基因不整合至靶细胞基因组,表达时间短，而且能够激起宿主细胞的免疫反应，本身对细胞的毒性较大，使其应用逐渐减少。随着近年来慢病毒等新兴病毒载体的发展，以其可以感染分裂及非分裂细胞、容纳外源性基因片段更大等优点，逐渐受到科学界的青睐。慢病毒(lentivirus)为RNA病毒，属逆转录病毒科，以HIV-1为基础构建的新型慢病毒载体(1entivirusvector,LV)系统是由慢病毒为骨架改造而来，且比逆转录病毒载体有更广的宿主范围。LV介导的基因转染有两大优点：一，可以将目的基因高效整合到宿主细胞的染色体上并随细胞增殖长期稳定表达；二，可以感染多种细胞类型，包括分裂细胞和非分裂细胞，且可以在体实现基因转导。在感染能力方面，可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。由此可见慢病毒已经成为现代细胞生物学研究中一种广泛应用的基因传递工具。从其安全性考虑，慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒，但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，因此操作时建议使用生物安全柜，穿实验服，戴口罩和手套，不要产生气雾或飞溅。慢病毒滴度对基因导入效率至关重要，然而不同方法包装的慢病毒其滴度差异很大，能否制备高滴度的慢病毒是提高效感染效率的前提。影响慢病毒包装滴度的因素有很多，包括包装质粒、膜囊质粒的选择及其纯度，HEK293T细胞状态、培养基条件，转染试剂等。虽然选用VSV-G膜蛋白包装的高滴度慢病毒提高了细胞的感染种类及感染效率，但是对不同细胞和组织的亲嗜性存在较大差别。目前，市场上出售的慢病毒滴度在108-109TU/mL，尚可满足部分实验需要，但对于小鼠巨噬细胞而言，其感染效率低，无法使目的基因在巨噬细胞上有效过表达。目前已有文献报道对于慢病毒感染人白血病单核细胞系THP-1效率达90%以上时，multiplicityofinfection(MOI)须达到60，即意味着需消耗大量病毒，如何制备高滴度慢病毒已成其瓶颈，而如何高效感染啮齿动物原代巨噬细胞尚未见相关文献报道。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用，滴度可达到1012copies/mL，功能活性滴度达到1010TU/mL，且可高效感染小鼠腹腔巨噬细胞，效率可达到90%以上。技术方案：高滴度慢病毒的制备试剂盒，包括：包装质粒和膜囊质粒，所述质粒混合物为包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev，与囊膜质粒VSV-G，用于细胞转染的BufferA:1MCaCl2，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的BufferB：1MNaHCO3，重悬病毒时减少病毒黏附损失的BufferC：302无血清培养基。上述试剂盒的应用，步骤为：（1）转染：细胞转染前24小时，用0.25%Trypsin-EDTA将长满15cm细胞培养皿的转染细胞进行消化，按1:10细胞数量传代至直径10cm细胞培养皿，每份培养皿加入10mLDMEM+10%FBS+1%PS培养基，第二天细胞汇合度达到80%以上；（2）转染前1小时，弃掉原培养基，每份直径10cm细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的6mLDMEM+10%FBS培养基；（3）病毒包装液的准备：将试剂盒中的质粒混合物60μL与转移质粒60μg分别加入到6mL无酚红DMEM培养基中并混匀，所述质粒混合物为包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev与囊膜质粒VSV-G按质量比1:1:1的混合物，加入试剂BufferA360μL，混匀，室温静置20~30分钟，每份培养皿中均匀滴入1mL病毒包装液，十字晃匀，置于37℃孵箱；（4）18小时后，吸出全部的病毒包装液至预先准备的84消毒液中，每份细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的12mLDMEM+10%FBS+1%BufferB培养基；（5）48~72小时后，收集上清，初步离心，3000rpm，5分钟；（6）准备0.45μm孔径滤器，用PBS+1%BufferC润湿；（7）将离心后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤，以去除细胞碎片；（8）将过滤后的病毒液体进行超速离心，18000rpm，2小时，4℃；（9）离心后弃上清，用200μLPBS+1%BufferC重悬，分装后于-80℃冰箱保存备用。上述转染细胞为HEK293T细胞及小鼠腹腔巨噬细胞。有益效果：利用4质粒表达系统共转染HEK293T细胞，收集病毒上清，超速离心后获得滴度达到1010TU/mL的病毒浓缩液，用其感染小鼠腹腔巨噬细胞两次，可达90%以上的感染效率。附图说明图1为高滴度慢病毒制备试剂盒流程图；图2为mCherry慢病毒功能活性滴度测定图；5×1010TU/mL慢病毒（mCherry）活性滴度检测（HEK293T细胞，感染96小时）图3为慢病毒（mCherry）感染小鼠腹腔巨噬细胞的病毒用量及效率统计图。具体实施方式下面的实例可使本专业技术人员全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1一、慢病毒制备试剂盒组成及实验流程本试剂盒采用4质粒慢病毒包装系统，由包装质粒(pMDLg/pRRE、pRSV-Rev)、膜囊质粒(VSV-G）、转移质粒组成。本试剂盒所提供用于细胞转染的BufferA，配合最适宜病毒包装环境的BufferB，重悬病毒时减少病毒损失的BufferC，可最终得到较高滴度的病毒液，实验重复性好，可信度高。1.产品组成（1）本试剂盒提供产品如下：质粒混合物：包装质粒和膜囊质粒中pMDLg/pRRE、pRSV-Rev与VSV-G（购自Addgene）按质量比1:1:1的混合物，4℃储存；转移质粒：4℃储存，需使用者根据实验需要插入目的基因片段；试剂：BufferA（1MCaCl2，2×BES）（4℃储存）BufferB（1MNaHCO3）（4℃储存）BufferC（302无血清培养基）（4℃储存）（2）自备试剂及相关仪器设备：细胞：HEK293T试剂：DMEM（Invitrogen，11995073）FBS（Invitrogen，16140）Glutamine（Invitrogen，25030）Penicillin/Streptomycin（Invitrogen，15140-122）0.05%Trypsin-EDTA（Invitrogen，25200056）DMEM(nophenolred)（Life，31053-028）耗材：0.45μm过滤器（Millipore，SLHV033RB）仪器：超速离心机（Beckman）离心机转头（BeckmanSW32Tirotor）2.试剂盒使用流程以包装6份10本文档来自技高网...

【技术保护点】
高滴度慢病毒的制备试剂盒，其特征在于包括：包装质粒和膜囊质粒，所述包装质粒为pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev，囊膜质粒为VSV‑G，用于细胞转染的Buffer A :1M CaCl2，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO3，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基。

【技术特征摘要】
1.高滴度慢病毒的制备试剂盒，其特征在于包括：包装质粒和膜囊质粒，所述包装质粒为pMDLg/pRRE、pRSV-Rev，囊膜质粒为VSV-G，用于细胞转染的BufferA:1MCaCl2，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的BufferB：1MNaHCO3，重悬病毒时减少病毒黏附损失的BufferC：302无血清培养基。2.权利要求1所述试剂盒的应用，其特征在于步骤为：（1）转染：细胞转染前24小时，用0.25%Trypsin-EDTA将长满15cm细胞培养皿的转染细胞进行消化，按1:10细胞数量传代至直径10cm细胞培养皿，每份培养皿加入10mLDMEM+10%FBS+1%PS培养基，第二天细胞汇合度达到80%以上；（2）转染前1小时，弃掉原培养基，每份直径10cm细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的6mLDMEM+10%FBS培养基；（3）病毒包装液的准备：将试剂盒中的质粒混合物60μL与转移质粒60μg分别加入到6mL无酚红DMEM培养基中并混匀，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈琪，贲晶晶，戚瑜，王冬冬，柏慧，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32