细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂制造技术

本发明专利技术提供一种细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂。本发明专利技术的麻疹病毒原液制备方法为：选用SPF鸡胚细胞，加入细胞培养液制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂中；将麻疹病毒的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005‑0.05)：1的比例接种于细胞工厂中，于33±1℃的温度下静置培养3‑4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞生长液继续培养；当细胞病变时，逐步收获单次麻疹病毒液。本发明专利技术技术方案实现在同等生产规模下，减少细胞消化批数，并获得高滴度的麻疹病毒液，有效提高麻疹系列疫苗产品质量的均一性，扩大制品的产能。

【技术实现步骤摘要】
细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂
本专利技术属于病毒疫苗
，涉及一种细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂。
技术介绍
麻疹是由麻疹病毒引起，经呼吸道传播的急性传染病，易感人群涵盖了所有无特异性免疫力及免疫力低下的儿童及成人。麻疹发病率及病死率在疫苗使用前位居儿童传染病之首。目前，疫苗接种仍旧是预防麻疹感染和控制其流行的最有效措施。现阶段，国内外麻疹病毒的培养多使用原代鸡胚细胞转瓶培养技术，转瓶技术为传统的贴壁细胞培养技术，细胞接种在旋转的圆筒形培养器——转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气。转瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，放大只需简单的增加转瓶数量等优点。但也有其缺点：(1)自动化程度低，人工操作工作量大，虽然有转瓶机辅助，但各个工序操作环节中仍需要大量的手工操作，不能实现自动化和标准化；(2)大量的清洗验证工作，清洗质量受人为因素的影响、难以保证清洗效果的一致性，人工和清洗验证成本逐年增加；(3)占用空间大产，在现有的条件下，转瓶本身的局限性难以产业化或规模化生产；(4)人工操作较繁琐，玻璃易碎，增加人员感染风险及操作环境的污染风险显著增加；(5)生产工艺可控性差，瓶间差异较大，难以保证制品质量的细胞批间一致性，且细胞生长成单层成纤维细胞的时间较长，需要72-96h；(6)病毒收获为单次收获，不能完整有效的利用细胞，影响产能的放大。采用转瓶培养技术2-3次收获病毒原液，但每次收获的单次病毒原液仅为2000-3000mL，且瓶间病毒滴度差异较大，多次打开瓶口也会造成污染的风险升高。目前，应用生物反应器进行大规模细胞培养亦称为国内外各个生产研究机构的关注重点，Vero细胞、人二倍体细胞应用生物反应器进行细胞培养已获得成功。但鸡胚、地鼠肾等原代细胞采用生物反应器进行培养还未有成功的报道。理论上讲，原代细胞培养利用生物反应器是可行的，但需进行长期的工艺摸索。因此，获得高滴度麻疹病毒原液，配制多联多价的含麻疹病毒的系列疫苗，提高产品质量的均一性，扩大麻疹系列疫苗产品的产能，降低污染的风险，进一步复合日益升级的GMP管理的要求，充分满足国家免疫规划的要求是目前亟待解决的技术。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂，从而实现在同等生产规模下，减少细胞消化批数，并获得高滴度的麻疹病毒液，有效提高麻疹系列疫苗产品质量的均一性，扩大制品的产能。本专利技术的目的通过以下技术方案得以实现；本专利技术提供一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其包括以下步骤：选用SPF鸡胚细胞，加入细胞培养液制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂中；将麻疹病毒的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005-0.05)：1的比例接种于细胞工厂中，于33±1℃的温度下静置培养3-4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞培养液继续培养；当细胞出现5％-10％的病变时，倾去细胞培养液，用不少于原细胞培养液量的洗液洗涤细胞表面，并换以病毒维持液继续培养；当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液。单次麻疹病毒液即为单批次生产的麻疹病毒原液，将同一细胞批生产收获的单次麻疹病毒液澄清过滤并检测合格后进行合并。上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述细胞培养液为灭能小牛血清的0.2％乳蛋白的Earle’s液。上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述细胞悬浮液制备方法为：选用9-11日龄来自SPF鸡群的鸡蛋，经消毒后取出鸡胚，去除鸡胚头部及内脏，剪碎；用0.125％的胰蛋白酶于37±1℃温度下对剪碎的鸡胚水浴消化18-22min，然后加入0.2％的乳蛋白Earle’s液进行分散处理，最后加入含灭能小牛血清的0.2％的乳蛋白Earle’s液作为细胞培养液，得到细胞悬浮液。上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液的具体操作为：当细胞出现50％病变时，进行第一次收获麻疹病毒液，收获后再加入新鲜的病毒维持液继续培养；继续培养12h后，进行第二次收获麻疹病毒液，收获后若细胞出现大量空洞或大面积拉网，则停止继续培养；否则再加入新鲜的病毒维持液继续培养；当细胞出现75％病变时，进行第三次收获麻疹病毒液。上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述麻疹病毒为麻疹病毒减毒株沪191。上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述洗液为Earle’s液。上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述病毒维持液为不含任何抗生素的M-199培养液。上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述细胞工厂为CF40。细胞工厂(CellFactory)是一种设计精巧的细胞培养装置，在有限的空间内利用了最大限度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间，无需进行任何厂房改造即可实现扩大产能的目的。可用于疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长的动力学条件，目前市售细胞工厂有1、2、10和40层的规格，使工艺研究和工艺放大变得简单易行，污染风险大大降低，节省空间，有效的保证操作的无菌性，最大限度降低细胞批间差异，实现操作规程化，且培养表面有利于细胞贴附和生长。同时，细胞工厂自动化操作设备可全面实现细胞培养的标准化，从而大大地减低劳动强度和密集度，替代传统的转瓶培养技术，实现大规模的细胞培养。本专利技术所采用的细胞工厂为CF40(40层细胞工厂细胞培养容器)，通过细胞工厂操作器完成细胞所需的液体洗换和多层细胞工厂显微观察系统，完成细胞生长情况观察和CPE的判定。本专利技术采用的SPF鸡胚细胞源于SPF(SpecificPathogenFree)鸡胚蛋，意指无特定病原。鸡胚细胞应选取30-60周龄的SPF鸡群所产的蛋，经37℃孵化9-11日，采取无菌操作技术取出鸡胚，并去除头及内脏，保留其组织，并将鸡胚组织剪成均一的组织块，经胰酶消化后制备成鸡胚细胞悬液。鸡胚细胞悬液按比例加入细胞生长液后分装至细胞培养容器中，在适宜的温度环境下培养2-3天即制备成成纤维状的原代鸡胚细胞。本专利技术采用的麻疹病毒为麻疹病毒减毒株沪191，经减毒获得沪191减毒株，经传代稳定性试验确定工作种子代次为鸡胚细胞的第16代至第32代。本专利技术还提供一种麻疹减毒活疫苗制剂，其是按照包括以下步骤的方法制备得到的：采用上述的方法制备的麻疹病毒原液，按照麻疹病毒滴度为5.11gCCID50/mL的配制点，加入保护剂混合，配制得到麻疹减毒活疫苗制剂。本专利技术还提供一种麻风联合减毒活疫苗制剂，其是按照包括以下步骤的方法制备得到的：采用上述的方法制备的麻疹病毒原液，与风疹病毒原液按照麻疹病毒和风疹病毒滴度均为5.11gCCID50/mL的配制点等比例混合，加入保护剂混合，配制得到麻风联合减毒活疫苗制剂。本专利技术还提供一种麻腮风联合减毒活疫苗制剂，其是按照包括以下步骤的方法制备得到的：采用上述的方法制备的麻疹病毒原液，与风疹病毒原液和腮腺炎病毒原液按照麻疹病毒和风疹病毒滴度均为4.51gCCID50/mL的配制点、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其包括以下步骤：选用SPF鸡胚细胞，加入细胞培养液制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂中；将麻疹病毒的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005‑0.05)：1的比例接种于细胞工厂中，于33±1℃的温度下静置培养3‑4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞培养液继续培养；当细胞出现5％‑10％的病变时，倾去细胞培养液，用不少于原细胞培养液量的洗液洗涤细胞表面，并换以病毒维持液继续培养；当细胞出现50％‑75％的病变时，收获单次麻疹病毒液。

【技术特征摘要】
1.一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其包括以下步骤：选用SPF鸡胚细胞，加入细胞培养液制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂中；将麻疹病毒的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005-0.05)：1的比例接种于细胞工厂中，于33±1℃的温度下静置培养3-4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞培养液继续培养；当细胞出现5％-10％的病变时，倾去细胞培养液，用不少于原细胞培养液量的洗液洗涤细胞表面，并换以病毒维持液继续培养；当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液。2.根据权利要求1所述的利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其中，所述细胞培养液为灭能小牛血清的0.2％乳蛋白的Earle’s液。3.根据权利要求1或2所述的利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其中，所述细胞悬浮液制备方法为：选用9-11日龄来自SPF鸡群的鸡蛋，经消毒后取出鸡胚，去除鸡胚头部及内脏，剪碎；用0.125％的胰蛋白酶于37±1℃温度下对剪碎的鸡胚水浴消化18-22min，然后加入0.2％的乳蛋白Earle’s液进行分散处理，最后加入含灭能小牛血清的0.2％的乳蛋白Earle’s液作为细胞培养液，得到细胞悬浮液。4.根据权利要求1所述的利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其中，当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液的具体操作为：当细胞出现50％病变时，进行第一次收获麻疹病毒液，收获后再加入新鲜的病毒维持液继续培养；继续培养12h后，进行第二次收获麻疹病毒液，收获后若细胞出现大量...

【专利技术属性】
技术研发人员：付永其，宋艳梅，杨云凯，高静，张颖欣，刘辉，孙雅，申亚楠，律苗，
申请(专利权)人：北京北生研生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11