一种猪流行性腹泻病毒制备方法技术

本发明专利技术提供了一种猪流行性腹泻病毒制备方法，该技术方案以细胞生长速率及培养产物病毒效价为依据考察了PEDV的理想宿主细胞，最终确定了以IPEC‑J2细胞替代Vero细胞用于PEDV培养的方案。实验发现IPEC‑J2细胞与PEDV间敏感性更强，接种病毒后细胞的病变率更高，同时，病毒在细胞内具有更高的复制水平，而且由于IPEC‑J2细胞生长速率较快，因此能缩短工艺流程。在培养工艺层面，本发明专利技术分析了传统转瓶培养的诸多不足，创新性的采用搅拌式生物反应器进行规模化培养，同时针对IPEC‑J2细胞以及PEDV的生物学特性，从微载体加入量、细胞接种密度、病毒接种量、病毒接种时细胞密度、收毒时间及反应器操作参数等角度匹配了适宜的条件，从而显著提升了病毒培养效率。

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒制备方法
本专利技术涉及兽用生物制品
，进一步涉及病毒的培养与增殖，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒制备方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度接触性传染病，其临床特征表现为仔猪呕吐、腹泻和脱水，病理变化主要表现在猪的空肠和回肠部分的肠绒毛萎缩和脱落，各种年龄猪均可发病，对哺乳仔猪危害最为严重，给养猪业带来重大经济损失。现有技术中，猪流行性腹泻病毒的培养主要是以VeroE6细胞作为宿主，该细胞在接种PEDV后病变率较低，而且即使发生病变，也难以获得较高的病毒效价，再加之该细胞增殖缓慢，因此现有技术中PEDV的培养效果亟待提升。近年来有研究者试图通过改变宿主细胞的方式提升病毒效价，然而理想的细胞株不仅要求其具有较高的PEDV病毒侵染率，而且病毒应当在宿主细胞中具有较高的复制水平，同时宿主细胞本身要有较高的生长速度和培养密度，在这种情况下，获得新的理想细胞并不容易；而且由于Vero细胞培养PEDV的工艺已经相对成熟，因此尚确定得具有取代意义的宿主细胞。此外，即使获得了新的理想宿主，由于不同细胞株具有完全不同的生物学特性，因此围绕其开发一套PEDV培养工艺也需要大量创造性劳动。以Vero细胞常用的转瓶培养为例，如果依然采用转瓶方法培养，那么仍可能存在生长速度缓慢、培养量较低等问题，而且由于转瓶培养条件下pH值、溶氧、培养基营养等参数无法实时监测，因而难以实现对细胞生长密度的最优控制；如果采用生物反应器培养，那么由于其培养规模较大，可控参数较多，因此如何在此规模基础上保证细胞增殖速率及病毒效价，需要密切围绕胞株、毒株特性进行工艺设计，而现有技术中尚未形成有效的工艺方法。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪流行性腹泻病毒制备方法，以解决现有技术的PEDV培养方法中，因宿主细胞性能不理想而影响培养效果的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是当采用IPEC-J2细胞作为宿主培养PEDV时，转瓶方法培养的自动化程度低、质量不稳定。本专利技术要解决的再一技术问题是当采用IPEC-J2细胞作为宿主培养PEDV时，产物病毒效价较低。本专利技术要解决的又一技术问题是当采用IPEC-J2细胞作为宿主培养PEDV时，如何开发一套基于生物反应器的规模化培养方法。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种猪流行性腹泻病毒制备方法，包括以下步骤：1)取IPEC-J2细胞，利用EDTA-胰酶分散液进行消化分散，而后加入细胞生长液在36～38℃条件下培养；2)当IPEC-J2细胞已长满单层时，向其中接入0.1～5％的PEDV，继续培养，至IPEC-J2细胞病变率超过50％、且培养物中病毒效价超过107.5TCID50/mL时，即得到生产用种毒；3)在搅拌式生物反应器内，将微载体以2～10g/L的用量与细胞生长液混合，得到混合培养基，再向其中接入0.3×106～1×106个/mL的IPEC-J2细胞，在pH6.5～7.5、温度36～38℃、溶氧40～80％、搅拌转速30～90rpm的条件下培养；4)当混合培养基中细胞密度达到2×106～5×106个/mL时，弃去混合培养基中的细胞生长液，加入细胞维持液，以0.1～5％的接种量接入步骤1)所得的生产用种毒，而后在pH7.0～7.4、温度36～38℃、溶氧35～60％、搅拌转速35～55rpm条件下培养；5)病毒接种后培养30～48h时，收获培养液，进行2次冻融，而后通过离心或过滤去除细胞碎片及微载体，所得上清液即为猪流行性腹泻病毒液。作为优选，步骤1)所述细胞生长液是含有8～12％(v/v)新生牛血清的DMEM培养基。作为优选，步骤1)所述EDTA-胰酶分散液，是含有0.25％(w/w)胰酶、0.02％(w/w)EDTA的PBS液；所述胰酶的活力为1:250。作为优选，所述微载体是Cytodex系列微载体。作为优选，所述搅拌式生物反应器的容积为14L。作为优选，步骤1)中用于培养的pH条件为6.8～7.2。作为优选，步骤1)中用于培养的温度条件为36～38℃。作为优选，步骤4)所述的细胞维持液是含有1～3％(v/v)新生牛血清的DMEM培养基。作为优选，步骤4)中弃去混合培养基中的细胞生长液时，IPEC-J2细胞的累计培养时间为72～120h。作为优选，步骤5)中收获培养液时，与微载体相脱落的IPEC-J2细胞数量达到IPEC-J2细胞总量的70％以上。作为优选，步骤5)中所述冻融，其冷冻温度为-20℃。作为优选，步骤5)最终得到的猪流行性腹泻病毒液，于-20℃条件下保存。作为优选，步骤5)最终得到的猪流行性腹泻病毒液中，病毒含量为108.0～8.5TCID50/ml。在以上技术方案中，所述搅拌式生物反应器是指以搅拌方式实现培养液流动的生物反应器，例如可以是具有机械搅拌桨的细胞培养罐。所述Cytodex系列微载体，仅限定于由GE公司出品的、型号为Cytodex的一系列微载体产品。本专利技术提供了一种猪流行性腹泻病毒制备方法，该技术方案以细胞生长速率及培养产物病毒效价为依据考察了PEDV的理想宿主细胞，最终确定了以猪小肠上皮细胞IPEC-J2替代Vero细胞用于PEDV培养的方案。由于IPEC-J2细胞与PEDV间敏感性更强，因此接种病毒后细胞的病变率更高，同时，病毒在细胞内具有更高的复制水平，有助于提升产物的病毒效价，而且，由于IPEC-J2细胞生长速率较快，因此能缩短工艺流程，并达到更高的培养密度。在培养工艺层面，本专利技术分析了传统转瓶培养的诸多不足，创新性的采用搅拌式生物反应器进行规模化培养，同时针对IPEC-J2细胞以及PEDV的生物学特性，从微载体加入量、细胞接种密度、病毒接种量、病毒接种时细胞密度、收毒时间及反应器操作参数等角度匹配了适宜的条件，从而显著提升了病毒培养效率。由于搅拌式生物反应器的操作范围较更大、混合性良好且更利于条件控制，因此可获得更高的生长速率和培养密度。与传统的转瓶培养相比，本专利技术方法自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，生产用地少，成本低，规模易于扩大；生产病毒滴度高，产品质量稳定，批间差异小。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1生物反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪流行性腹泻病毒制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)取IPEC‑J2细胞，利用EDTA‑胰酶分散液进行消化分散，而后加入细胞生长液在36～38℃条件下培养；2)当IPEC‑J2细胞已长满单层时，向其中接入0.1～5％的PEDV，继续培养，至IPEC‑J2细胞病变率超过50％、且培养物中病毒效价超过10

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)取IPEC-J2细胞，利用EDTA-胰酶分散液进行消化分散，而后加入细胞生长液在36～38℃条件下培养；2)当IPEC-J2细胞已长满单层时，向其中接入0.1～5％的PEDV，继续培养，至IPEC-J2细胞病变率超过50％、且培养物中病毒效价超过107.5TCID50/mL时，即得到生产用种毒；3)在搅拌式生物反应器内，将微载体以2～10g/L的用量与细胞生长液混合，得到混合培养基，再向其中接入0.3×106～1×106个/mL的IPEC-J2细胞，在pH6.5～7.5、温度36～38℃、溶氧40～80％、搅拌转速30～90rpm的条件下培养；4)当混合培养基中细胞密度达到2×106～5×106个/mL时，弃去混合培养基中的细胞生长液，加入细胞维持液，以0.1～5％的接种量接入步骤1)所得的生产用种毒，而后在pH7.0～7.4、温度36～38℃、溶氧35～60％、搅拌转速35～55rpm条件下培养；5)病毒接种后培养30～48h时，收获培养液，进行2次冻融，而后通过离心或过滤去除细胞碎片及微载体，所得上清液即为猪流行性腹泻病毒液。2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒制备方法，其特征在于步骤1)所述细胞生长液是含有8～...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂红，王和平，樊翠，付旭彬，郁宏伟，梁武，李守军，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12