噬菌体疗法制造技术

本发明专利技术涉及噬菌体疗法。更具体来说，本发明专利技术涉及对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株具有高特异性的新的噬菌体、它们的制造、其组分、包含它们的组合物及其在噬菌体疗法中的用途。

Bacteriophage therapy

The invention relates to phage therapy. More specifically, the present invention relates to Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) strains with high specificity of the new phage, their manufacture, components thereof, compositions containing them and their use in phage therapy in.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】噬菌体疗法本专利技术涉及新的噬菌体组合物、它们的制造及其用途。本专利技术特别适合于治疗哺乳动物中、特别是呼吸系统中的感染。
技术介绍
噬菌体是表现出侵染并杀死细菌的能力的小病毒，同时它们不影响来自于其他生物体的细胞。噬菌体最初由WilliamTwort在几乎一个世纪之前描述，并在其后不久被Félixd’Herelle独立地发现，迄今为止已发现并在形态学上描述了超过6000种不同的噬菌体，包括细菌和古菌(archeal)的病毒。这些病毒绝大多数有尾，而少部分是多面体、丝状或多形性的。它们可以按照它们的形态、遗传内含物(DNA还是RNA)、特异性宿主、生活地点(海洋病毒还是其他栖息地)和生命周期进行分类。作为细菌细胞的细胞内寄生物，噬菌体在细菌宿主内表现出不同的生命周期：裂解性、溶原性、假溶原性和慢性感染(Weinbauer，2004；Drulis-Kawa，2012)。作为其生命周期的正常部分，裂解性噬菌体引起宿主细菌细胞的裂解。溶原性噬菌体(也被称为温和噬菌体)可以利用裂解性生命周期进行复制并引起宿主细菌裂解，或者它们可以将其DNA并入到宿主细菌DNA中并变成非感染性前噬菌体。不论噬菌体的周期是何种类型，第一步是附着于细菌细胞壁的受体，然后噬菌体材料才可能进入细菌。这个特异性过程影响可能的噬菌体-细菌相互作用的范围。噬菌体通常作为研究工具用于在实验室实验中改良细菌。由于它们的靶宿主细胞特异性，已考虑将噬菌体用作疗法以治疗急性和慢性感染，特别是在皮肤病学、眼科学、泌尿科学、口腔病学、儿科学、耳鼻喉科学或外科学中。然而，这种噬菌体治疗细菌感染的治疗性用途的概念，从一开始就极富争议，并且未被公众或医学界广泛接受。早期研究由于缺少适合的对照并且结果不一致而广受批评。缺乏可重复性和在各种发表的研究中获得的许多冲突的结果，使美国医学联合会药学与化学理事会(CouncilonPharmacyandChemistryoftheAmericanMedicalAssociation)得出关于裂解滤液的治疗价值的证据在极大程度上是矛盾的、不足以令人信服的结论，并推荐进行进一步研究以确认它声称的益处。自从在1940年代引入抗生素以来，很少有人注意治疗学的这个领域，特别是在西方世界。但是抗生素的广泛使用已在全世界引起抗生素抗性细菌的广泛出现和传播，造成越来越严重的问题。因此，克服有限的剩余治疗选项以治疗主要的多药物抗性微生物，已变成主要的治疗挑战。自从在19世纪晚期初次发现(Fordos1859)以来，革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)已在恶名昭著的人类病原体的名单中获得声名狼藉的地位(Williams等，1894；Freeman等，1916)。抗生素时代的来临大大缓和了急性感染在健康患者中的以前致命的结果。在主要发生在患有囊性纤维化或严重烧伤的个体或免疫受损个体中的慢性感染的根治中，仅获得相对改善(Gang等，1999；Jones等，2010)。在这些患者中感染的致死结果中的两个内在相关的因素是不适当的抗生素治疗的快速处方和多药物抗性菌株的发生或获得。尽管已报道在铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染的根治中使用适合的抗生素是必不可少的因素(Kang等，2005；Micek等，2005)，但相反，抗生素滥用通过对抗性逐渐提高这种能力的获得施加连续的选择压力，显著地促成了抗性逐渐提高。抗生素不能单独解释多药物抗性变体的高度流行：铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)具有染色体编码的多种固有抗性机制，包括细胞被膜的低通透性和大量多药物外排泵。负责这种细菌的成功的侵入行为和持久性的另一个主要因素是它的高适应性，允许不同环境的快速定殖。此外，致病细菌例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)能够形成生物膜，这促成了它们对抗生素的抗性增加。这种生物膜可能包含被分泌的细胞外基质支持并包围的超过一种类型的细菌，并帮助细菌定殖于各种不同表面。生物膜允许细菌附着于表面并达到原本不可承受的群体密度，不仅对抗生素而且对许多环境胁迫(包括毒素如重金属、漂白剂和其他清洁剂)提供增加的抗性。已知生物膜中的细菌对抗生素的抗性可以比以浮游形式生长的同一细菌菌株的抗性高100到1000倍。这种增加的抗性意味着在实验室试验中明显对抗生素敏感的细菌在临床背景中可能对疗法有抗性。即使一些细菌被清除，生物膜也可以提供抗性储库，允许在一旦抗生素不再存在后快速定殖。因此，显然生物膜在许多人类疾病中是重要因素。化学治疗不适合用于对抗生物膜，因为这恰恰是它们进化以对抗的情况。物理磨蚀确实提供了破坏生物膜的一种手段。不幸的是，生物膜支持细菌性发病所在的许多表面，即骨骼、关节、植入的医疗装置等，不太适合严酷磨蚀。例如，伤口或烧伤的表面极为敏感和柔弱。即使在磨蚀既适合也被常规使用之处，生物膜的清除也是有限的。牙齿表面上的口腔菌斑是生物膜并通过日常刷牙被部分清除。然而，细菌维持在未刷洗表面上(例如牙齿之间的缝隙中)，并且可以快速且有效地重新定殖在被清除的表面上。由此可以清楚看出，现有的清除生物膜的方法的功效有限。快速适应能力和形成生物膜的能力是将铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)鉴定为机会致病菌的主要原因。它们已获得医院致病菌的地位，并且可以从获取自伤口、痰液、膀胱、尿道、阴道、耳、眼和呼吸道的临床样品分离。在这些临床铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株中出现对最强有力的新抗生素的抗性，甚至在治疗期间出现，使得与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)医院致病菌的战斗成为极大难题。因此，对于可用于毁灭即使是组织在细菌生物膜中的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株，适合于在人类或动物疗法中使用以及适合于对材料消毒的新的抗细菌剂或组合物，存在着极大需求。
技术实现思路
本专利技术人已分离并表征了对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(P.aeruginosa)菌株表现出强烈且特异性的裂解活性的新噬菌体。这些噬菌体、特别是组合，提供了非常强的抗细菌效果，并且可作为活性剂用于药物制剂或兽医制剂，特别是用于治疗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌感染。本专利技术的一个目的是提供抗细菌组合物，其包含对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的至少两种噬菌体，所述至少两种噬菌体选自具有包含SEQIDNO：1至7任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体。本专利技术的另一个目的涉及一种噬菌体，其对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性，并具有包含选自SEQIDNO：2至7任一者的核苷酸序列或与其具有至少95％同一性的序列的基因组。本专利技术的噬菌体对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的多药物抗性菌株、特别是对抗生素抗性致病菌株例如头孢菌素酶、羧苄青霉素酶、碳青霉烯酶和/或广谱β-内酰胺酶抗性菌株，表现出强的裂解活性，并因此特别适合于并有利于治疗细菌感染。本专利技术还涉及被包含在本专利技术的噬菌体中的分离的核酸分子，优选为包含选自SEQIDNO：2至7任一者的核苷酸序列或与其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗细菌组合物，其包含对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的至少两种噬菌体，所述至少两种噬菌体选自具有包含SEQ ID NO：1至7任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.07 EP 14306788.61.一种抗细菌组合物，其包含对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的至少两种噬菌体，所述至少两种噬菌体选自具有包含SEQIDNO：1至7任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体。2.权利要求1的组合物，其包含至少三种、甚至更优选地至少四种不同的噬菌体，所述噬菌体选自具有包含SEQIDNO：1至7任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体。3.权利要求1的组合物，其至少包含：具有包含SEQIDNO：3或4的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体。4.权利要求1或3的组合物，其包含：.具有包含SEQIDNO：4的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体；以及.具有包含SEQIDNO：6的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体。5.权利要求1的组合物，其包含表4的噬菌体混合物中的任一者。6.权利要求1或2的组合物，其包含：.具有包含SEQIDNO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体；.具有包含SEQIDNO：2的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体；.具有包含SEQIDNO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体；.具有包含SEQIDNO：4的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体；.具有包含SEQIDNO：5的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的基因组的噬菌体；.具有包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗莱维雅·颇伊洛特，海伦妮·布洛伊斯，
申请(专利权)人：飞瑞赛德斯制药公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR