一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法，包括将人偏肺病毒接种于人细胞中，离心，得到被病毒高效感染的人细胞。本发明专利技术通过离心实现人偏肺病毒对人细胞的高效感染，为今后病毒的分离和感染免疫研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法
本专利技术涉及病毒感染
，特别是涉及一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法。
技术介绍
人偏肺病毒(humanmetapneumovirus，hMPV)属于副黏病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属，是该属中第一个能够引起人类感染的病毒。自2001年hMPV首次被荷兰学者分离发现以来，各国家和地区相继报道了该病毒的感染流行情况，且血清学调查显示其流行至少超过50年，而国内在2003年才见相关报道。hMPV可分为A1、A2、B1和B2四个基因亚型，每个国家或地域流行的hMPV亚型不尽相同，同一地区不同亚型可同时发生，优势交替。hMPV同它相近的同病毒科成员呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialviruspneumonia，RSV)一样，是引起儿童下呼吸道感染的主要病因，临床症状表现为咳嗽、踹息甚至严重的肺炎，呼吸衰竭等。hMPV感染多发生于冬季和早春，常与RSV混合感染导致更严重的临床症状。hMPV感染以5岁以内儿童、免疫功能低下者和老年人最多见，其中5岁以内患儿hMPV检出率可高于90％，且在喘息性支气管炎、毛细支气管炎患儿的中hMPV检出率较高。hMPV也是世界范围内引起免疫功能低下者和老年人发病及死亡的常见原因，hMPV中和抗体作用较弱，感染后不能形成稳定有效的免疫保护，所以成年后仍可再感染，反复的感染发生加重了家庭和社会的医疗负担。但是人偏肺病毒自发现以来，有两大问题一直困扰其研究进展，第一：病毒分离困难，至今全球仍然只有几家实验室能够分离该病毒；第二：病毒的人气道上皮细胞感染模型的建立，目前对于该病毒的研究主要集中在猴肾源性的细胞系(Vero-E6，LLC-MK2)，不能较好地模拟病毒感染人气道后的天然免疫状况。因此，作为儿科呼吸道感染的新发且重要病原体，hMPV对人呼吸道上皮细胞自然低感染率严重制约了我们对hMPV的进一步认识。而本研究立足于人偏肺病毒研究的难点，尝试通过简便易行的低速离心方式，建立并评估高效的人气道感染模型，为今后病毒的分离和感染免疫研究奠定基础。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法，用于解决现有技术中人偏肺病毒感染的研究仅仅停留在动物细胞层面、不能较好地模拟人偏肺病毒感染人细胞模型的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供第一方面一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法，包括：将人偏肺病毒接种于人细胞中，离心，得到被病毒高效感染的人细胞。在本专利技术的一些实施例中，所述人细胞选自人支气管上皮细胞系。优选地，所述人细胞选自人支气管上皮细胞系16HBE细胞。在本专利技术的一些实施例中，将人偏肺病毒接种于人细胞时，病毒感染复数MOI为0.5-50。优选地，病毒感染复数MOI为0.5-5。优选地，离心前，孵育0-60min。在本专利技术的一些实施例中，离心前，孵育时间为0-30min。优选地，离心前，孵育时间为30min。在本专利技术的一些实施例中，离心力为150-2300g。优选地，离心力为600-2300g。在本专利技术的一些实施例中，离心时间为5-60min。在本专利技术的一些实施例中，离心时间为5-30min。优选地，离心时间为10min。在本专利技术的一些实施例中，细胞的孵育温度为37℃。本专利技术提供第二方面提供上述方法建立的病毒感染模型。如上所述，本专利技术的人偏肺病毒高效感染人细胞的方法，具有以下有益效果：本专利技术通过离心实现人偏肺病毒对人细胞的高效感染，为今后病毒的分离和感染免疫研究奠定基础。附图说明图1显示为本专利技术实施例的hMPV感染VeroE6细胞光镜图。图2显示为本专利技术实施例的hMPV感染LLC-MK2细胞光镜图。图3显示为本专利技术实施例的hMPV感染后16HBE细胞光镜图。图4显示为本专利技术实施例的hMPV感染16HBE、VeroE6和LLC-MK2细胞平均荧光强度对比图。图5显示为本专利技术实施例中不同MOI与不同离心力对hMPV感染16HBE的影响图。图6显示为本专利技术实施例中不同MOI与不同时间段离心对hMPV感染16HBE的影响图。图7显示为本专利技术实施例中MOI＝0.5时16HBE细胞内N蛋白荧光数结果图。图8显示为本专利技术实施例中MOI＝5时16HBE细胞内N蛋白荧光数结果图。图9显示为本专利技术实施例中MOI＝50时16HBE细胞内N蛋白荧光数结果图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。此外应理解，本专利技术中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本专利技术中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。呼吸道感染是人类最常见的感染性疾病，对于婴幼儿，人偏肺病毒(humanmetapneumovirus，hMPV)是仅次于呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialviruspneumonia，RSV)的引起肺炎等严重呼吸道感染的第二位病原体，5岁以下儿童，65岁以上的老人，免疫功能抑制者更容易感染hMPV。hMPV感染引起的临床症状与RSV类似，包括肺炎，支气管炎，气管炎，中耳炎等，对于器官移植病人，甚至有因移植后感染hMPV导致死亡的案列。对于成年人，潜在的心肺疾病是反复感染hMPV的最重要的高危因素。除了临床表现，hMPV的传染途径也与呼吸道合胞病毒相似，主要都是通过空气飞沫传播，hMPV的感染潜伏期通常在4-6天，之后的5天-2周为排毒期。hMPV常与RSV等其他病毒合并感染引起更严重的临床症状，甚至危及患儿生命。hMPV检测常采用直接免疫荧光、实时荧光定量PCR或ELISA血清学检测，但是目前为止，hMPV诊断检测并未纳入医院的常规检测并大面积推行。病毒研究可分为体内研究和体外研究，体内研究往往能提供很有价值的信息，但是人体志愿者往往很缺乏，因此需要易感性高或同源性均高的物种代替人体试验，hMPV体内研究可用近交小鼠，非人灵长类动物等，但常常价格昂贵，且部分实验动物来源珍贵。相反，体外细胞实验操作较简单，实验条件易控制，价格较便宜，是hMPV研究的良好选择，因病毒因缺少编码线粒体和核糖体的基因，必须在活细胞内寄生，而病毒感染细胞的能力和方式千差万别，所以细胞实验一定要考虑细胞株的易感性和同源性的问题。hMPV不同于RSV，因感染前期常不引起明显的细胞毒病变，且感染率低，严重阻碍了hMPV的相关研究，因此，提高hMPV感染率很有必要。hMPV是一种非常常见的引起上、下呼吸道感染的呼吸道病毒，主要攻击人的呼吸道本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法，其特征在于：包括将人偏肺病毒接种于人细胞中，离心，得到被病毒高效感染的人细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法，其特征在于：包括将人偏肺病毒接种于人细胞中，离心，得到被病毒高效感染的人细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人细胞选自人支气管上皮细胞系。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述人细胞选自人支气管上皮细胞系16HBE细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将人偏肺病毒接种于人细胞时，病毒感染复数MOI为0.5-50。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：病毒感染复数MOI为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵耀，陈素花，何浩，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50