获得病毒的方法技术

本发明专利技术提出一种获得病毒的方法，该方法包括：利用病毒种子感染宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293细胞，且所述宿主细胞为悬浮培养在无血清培养基中的宿主细胞；以及将感染后的宿主细胞继续进行悬浮培养，以便获得病毒，其中，在进行所述感染时，所述病毒种子的病毒感染复数为10～50，所述宿主细胞在所述无血清培养基中的浓度为1.0～3.0×10

The way to get the virus

The invention provides a method for obtaining the virus, the method includes: host cells infected by virus seed, the host cells to HEK293 cells and the host cells in suspension culture medium without serum and host cells; the infected host cell suspension to culture, in order to get the virus. In the infection, when the virus seed virus MOI was 10 ~ 50, the host cells in the serum-free medium concentration is 1 ~ 3 * 10

【技术实现步骤摘要】
获得病毒的方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及获得病毒的方法。
技术介绍
基因治疗是将人正常基因或者有治疗功能的基因导入人体靶细胞发挥治疗作用，曾在2009年被评为十大成功之一，直至今天，世界各国已批准数千个基因治疗临床试验的项目。腺病毒载体是基因治疗的关键载体之一，表现出高效、靶向、不整合到细胞基因组、安全系数高、可长期表达目的基因片段、可制备高效价的病毒颗粒等优点。故大批量生产腺病毒载体成为基因治疗深入研究和市场推广关键位点之一。
技术实现思路
专利CN200480038524.4公开“生产在无血清的培养基悬浮培养中稳定的A549细胞系的方法”，该专利中公开采用无血清驯化培养的A549进行生产腺病毒的方法。专利技术人经过实验研究发现，采用无血清驯化培养的HEK293细胞生产病毒，如腺病毒，且生产过程中不添加氯化钙，批量产出的腺病毒的滴度可达3×1012pfu/batch，腺病毒的比活大于1.5％，不仅腺病毒的产量更大、比活更高，而且工艺简单无需灌注，培养过程中无需补加氯化钙，减少工艺程序，降低污染风险，工艺简单容易操作，可以实现工业化生产，生产成本大幅降低。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出一种获得病毒的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：利用病毒种子感染宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293细胞，且所述宿主细胞为悬浮培养在无血清培养基中的宿主细胞；以及将感染后的宿主细胞继续进行悬浮培养，以便获得病毒，其中，在进行所述感染时，所述病毒种子的病毒感染复数为10～50，所述宿主细胞在所述无血清培养基中的浓度为1.0～3.0×106cells/ml。根据本专利技术的实施例，该方法中所用宿主细胞HEK293是经过无血清培养驯化过的HEK293细胞，该细胞相比于A549细胞，生存能力更强、产毒效率更高。利用根据本专利技术实施例的获得病毒的方法，所得病毒滴度高、比活大，符合临床药用要求。且根据专利技术的实施例，本专利技术的获得病毒的方法，工艺简单无需灌注，培养过程中无需补加氯化钙，减少工艺程序，降低污染风险，工艺简单容易操作，可以实现工业化生产，生产成本大幅降低。根据本专利技术的实施例，上述获得病毒的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述宿主细胞在所述无血清培养基中的接种密度为3.0～5.0×105cells/ml。专利技术人经过实验发现，宿主细胞以3.0～5.0×105cells/ml的接种密度进行接种，可以保证接种后，宿主细胞在无血清培养基中健康的生长状态。专利技术人发现，接种密度低于3.0×105cells/ml，细胞密度过低，细胞生长缓慢，接种密度高于5.0×105cells/ml，细胞密度过高，细胞生长受到抑制，细胞状态受到显著影响。根据本专利技术的实施例，将感染后的宿主细胞继续进行悬浮培养24～48h，以便获得病毒。专利技术人经过实验发现，感染后的宿主细胞悬浮培养24～48h，此时收集病毒，可最大可能地保证病毒的活力和数量的最大化。根据本专利技术的实施例，将感染后的宿主细胞继续进行悬浮培养24～48h的过程中，葡萄糖在所述无血清培养基中的浓度为2～5g/L。专利技术人发现，病毒在感染、包装和扩增过程中不断地消耗葡萄糖，控制培养基中葡萄糖在2～5g/L，可有效保证病毒感染、包装和扩增的高效和稳定。根据本专利技术的实施例，所述病毒为腺病毒、慢病毒或逆转录病毒。利用本专利技术实施例所提出的获得病毒的方法，可批量获得腺病毒、慢病毒或逆转录病毒，病毒产率高、比活大。根据本专利技术的实施例，所述无血清培养基为GibcoCD293AGTTM/AEM,HycloneCDM4/SFM4/PF-293*/SFMTransfx。专利技术人经过筛选实验发现，本专利技术的宿主细胞HEK293细胞在GibcoCD293AGTTM/AEM,HycloneCDM4/SFM4/PF-293*/SFMTransfx培养基中的生长状态相比于在其它培养基中的生长状态，更加健康，病毒产率更高。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出一种获得病毒的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：1)HEK293细胞种子接种到生物反应器的无血清培养基GibcoCD293AGTTM/AEM,HycloneCDM4/SFM4/PF-293*/SFMTransfx中，接种密度为3.0～5.0×105cells/ml，并继续在生物反应器中进行悬浮培养；2)当HEK293密度达到1.0～3.0×106cells/ml时，用腺病毒种子以病毒感染复数为10～50直接感染细胞并继续进行悬浮培养，葡萄糖的浓度控制在2～5g/L；以及3)通过监测接毒后生物反应器内培养的细胞活率，当感染后24～48h，结束培养，分别收集细胞及培养上清，以便获得腺病毒。利用根据本专利技术实施例的获得病毒的方法，所得病毒滴度高、比活大，符合临床药用要求。根据本专利技术的实施例，上述获得病毒的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，HEK293细胞种子预先复苏并扩增培养在无血清培养基中，HEK293细胞种子的复苏密度为3.0～5.0×105cells/ml，当生长到2.0～4.0×106cells/ml左右时，以细胞密度为3.0～5.0×105cells/ml进行扩增培养。专利技术人通过实验发现，HEK293细胞种子在上述复苏密度(3.0～5.0×105cells/ml)、传代临界密度(2.0～4.0×106cells/ml)和扩增密度(3.0～5.0×105cells/ml)下，HEK293细胞种子更加健康、生长状态更好，将此生长状态好且健康的细胞种子进行接种扩毒，细胞的产毒效率更高。根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括对所获得的腺病毒进行纯化。纯化进一步提高病毒的滴度，所得病毒更加安全。需要说明的是，本申请中所提到的“经过无血清培养驯化过的细胞”，是指细胞经过无血清培养基的适应培养，细胞已经能够完全适应无血清的生长环境，在无血清的培养基中具有持续生长的能力。附图说明图1显示了根据本专利技术实施例的HEK293细胞不同初始密度的生长曲线；图2显示了根据本专利技术实施例的不同的接毒细胞密度对生产重组腺病毒AD-HGF的影响；图3显示了根据本专利技术实施例的不同的MOI对HEK293细胞生产重组腺病毒AD-HGF的影响；以及图4显示了根据本专利技术实施例的不同的收毒时间对HEK293细胞生产重组腺病毒AD-HGF的影响。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1在本实施例中，专利技术人以在7.5L搅拌式生物反应器中生产AD-HGF为例，详细介绍获得腺病毒的方法。1材料及仪器细胞：HEK293细胞(人胚肾细胞)；培养基：细胞培养基GibcoCD293AGTTM/AEM,HycloneCDM4/SFM4/PF-293*/SFMTransfx(简写为CD293/SFM4)；病毒：AD-HGF是经过基因工程改造过的，无复制能力的重组人5型腺病毒；生物反应器：7.5L的生物反应器(美国NBS公司，310本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得病毒的方法，其特征在于，包括：利用病毒种子感染宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293细胞，且所述宿主细胞为悬浮培养在无血清培养基中的宿主细胞；以及将感染后的宿主细胞继续进行悬浮培养，以便获得病毒，其中，在进行所述感染时，所述病毒种子的病毒感染复数为10～50，所述宿主细胞在所述无血清培养基中的浓度为1.0～3.0×10

【技术特征摘要】
1.一种获得病毒的方法，其特征在于，包括：利用病毒种子感染宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293细胞，且所述宿主细胞为悬浮培养在无血清培养基中的宿主细胞；以及将感染后的宿主细胞继续进行悬浮培养，以便获得病毒，其中，在进行所述感染时，所述病毒种子的病毒感染复数为10～50，所述宿主细胞在所述无血清培养基中的浓度为1.0～3.0×106cells/ml。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞在所述无血清培养基中的接种密度为3.0～5.0×105cells/ml。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将感染后的宿主细胞继续进行悬浮培养24～48h，以便获得病毒。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将感染后的宿主细胞继续进行悬浮培养24～48h的过程中，葡萄糖在所述无血清培养基中的浓度为2～5g/L。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒为腺病毒、慢病毒或逆转录病毒。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基为GibcoCD293AGTTM/AEM,HycloneCDM4/SFM4/PF-293*/SFMT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学海，马梵辛，许勇，任科云，叶炜，陈艳，袁宏丽，何昆，田吕明，黄璐，刘哲，肖强，
申请(专利权)人：武汉光谷人福生物医药有限公司，武汉珂美立德生物医药有限公司，湖北生物医药产业技术研究院有限公司，人福医药集团股份公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42