一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用。本发明专利技术从福建省猪场发生猪特发性水疱病的病料中分离到塞内加谷病毒毒株CH‑FJZZ‑2017，保藏编号为CGMCC No.12160。本发明专利技术分离的猪塞内加谷病毒CH‑FJZZ‑2017株是中国境内新近爆发流行该病的猪群中分离得到的，代表目前国内流行优势毒株，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。

A strain of swine virus strain and its application in Seneca Valley

The invention discloses a porcine Seneca Valley virus strain and application thereof. Disease of material of the invention from Fujian province pig swine vesicular disease idiopathic isolated virus strain CH FJZZ Seneca Valley 2017, the preservation number is CGMCC No.12160. The invention of the Seneca Valley virus isolated porcine CH FJZZ 2017 strains were isolated from the recent outbreak of the disease in Chinese pigs, on behalf of the current domestic dominant strain, strain has a good background, can be used as vaccine strains and tested by virus, which provided materials for the related subsequent experimental study, laid the material foundation.

【技术实现步骤摘要】
一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用
本专利技术涉及病原微生物领域，属于受用生物制品领域，具体涉及一株猪塞内加谷病毒毒株在制备猪塞内加谷病毒灭活疫苗中的应用。
技术介绍
塞内加谷病毒(SenecavirusA，SVA)又称为SenecaValleyvirus(SVV)，是一种无囊膜单股正链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞内加谷(Senecavirus)病毒属。SVA基因组全长约7.3kb左右，包括一个开放阅读框及两端非编码区序列。SVA编码一个多聚蛋白，大小为2181aa，该蛋白能够被宿主细胞和病毒自身的蛋白酶水解，形成12种蛋白，分别为L、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D等。其中，VP4、VP2、VP3、VP1是SVA的结构蛋白，VP2、VP3、VP1蛋白位于病毒的衣壳表面，能够诱导机体产生良好的免疫反应。SVA是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病(swineidiopathicvesiculardisease,SIVD))及流行性暂时性新生仔猪损失(epidemictransientneonatallosses,ETNL)急性病原微生物，该病发病率高，病程快，传播速度快，死亡率较低，但仔猪死亡率高。临床上主要表现为猪鼻镜、蹄部冠状带水泡、溃烂，跛足、嗜睡，新生仔猪腹泻及急性死亡等症状。SVA临床症状与口蹄疫、猪水疱病、水泡性口炎等类似，通过临诊诊断难以区分。该病感染谱较窄，暂无该病原自然感染牛、羊、犬、猫等家畜动物的报道。SVA引起的猪特发性水疱病首次在美洲国家被报道，例如美国，巴西，加拿大，继而在我国以及泰国、哥伦比亚等地陆续报道。2015年，我国广东地区首发塞内加谷疫情，在2016及2017年，塞内加谷疫情继续蔓延，在我国多个省市暴发，疫情范围波及广东、福建、湖南、河南、黑龙江等省份，临床症状以水疱类病变为特点，偶见低日龄仔猪大量死亡，给养猪业带来巨大经济损失，严重威胁了我国的公共卫生安全及养殖业发展。目前关于该病的防控尚无可用的生物疫苗制品。目前，猪塞内加谷病的防控依赖于猪场有效管理，但国内养猪模式复杂多样，猪场管理较为落后，鉴于塞内加谷病毒的病原特点，研制相应的生物制品防控该疫病的暴发流行十分迫切。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一株新分离的猪塞内加谷病毒流行毒株。本专利技术的另一目的是针对现有塞内加谷病毒生物制品的不足，提供一种有效安全的猪用塞内加谷疫苗以及该灭活疫苗的制备方法；该灭活疫苗所采用的制备方法简单安全，疫苗免疫效果良好。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术首先提供一株塞内加谷病毒，名称为塞内加谷病毒(SenecavirusA)CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160。该病毒分离自猪，又称猪塞内加谷病毒；国际病毒分类委员会将其分类为：Picornavirus，Senecavirus；属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞内加谷(Senecavirus)病毒属，本专利技术的猪塞内加谷病毒SenecavirusA(SVA)CH-FJZZ-2017株分离自福建省内发生非口蹄疫、猪水疱病、水泡性口炎疫情的猪场。已于2017年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.12160。上述猪塞内加谷病毒的分离培养方法，具体步骤如下：采集塞内加谷病毒感染患猪水疱皮病变样品，剪碎后用含有100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的无菌PBS制成1:5的悬液，研磨，涡旋振荡混匀，反复冻融3次，10000×g离心10min，上清用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-70℃，备用；将1×106个PK-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS洗涤两次；将1mL过滤的塞内加谷病毒处理液接种PK-15细胞，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO2培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2mL维持液，继续培养4～5d，每天观察细胞状态；待发生明显的细胞病变时，将细胞冻融3次后，收集细胞和培养液继续传代培养，同时对每一代细胞培养物进行RT-PCR鉴定；待接毒PK-15组出现稳定、明显的细胞病变时，即分离得到一株稳定传代的猪塞内加谷病毒毒株。上述猪塞内加谷病毒的蚀斑纯化方法，具体步骤如下：1)制备单层PK-15细胞，加入稳定传代的塞内加谷病毒液，吸附2h；2)将吸附后的细胞用PBS洗涤两次，表面覆盖一层培养哺乳动物细胞用固体培养基，待其凝固，倒置培养至病毒蚀斑出现；3)挑取8～10个病毒蚀斑，接种单层PK-15细胞，待其细胞发生病变，收获病毒培养物；4)将收获的病毒培养物进行下一轮的克隆纯化试验，进行3轮蚀斑纯化试验，获得塞内加谷病毒克隆纯化毒株。本专利技术提供的猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160能够用于制备预防由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗，还能够用于制备猪塞内加谷病毒相关的诊断试剂和治疗药物。本专利技术提供一种预防由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗，其活性成分为经灭活的塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160；具体的该疫苗含有经灭活的塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160和药学上可接受的佐剂。本专利技术还公开了上述疫苗的制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)病毒培养：将猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160接种至PK-15细胞进行培养，收获病毒培养物；2)病毒培养物的灭活，病毒培养物经反复冻融三次，离心，收取上清，加入灭活剂，将病毒灭活，得到灭活的病毒液；3)按比例混合灭活的猪塞内加谷病毒病毒液和佐剂，乳化，制备猪塞内加谷病毒灭活疫苗。根据上述疫苗组合物的制备方法，其中步骤1)的具体过程为：用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱贴壁培养PK-15细胞；待其融合度达到80％左右时，弃去培养液，按感染复数为1接种猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株，然后用含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱贴壁培养48h左右，待细胞完全病变后收获细胞培养物。根据上述疫苗组合物的制备方法，步骤2)所述灭活剂为二乙烯亚胺，病毒液中加入二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，灭活条件为30℃灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。灭活效果接种PK-15盲传3代未出现病变为灭活合格。根据上述疫苗组合物的制备方法，步骤3)所述的佐剂为ISA206或ISA201，灭活病毒液与佐剂的体积比例为1:1。本专利技术的积极有益效果：本专利技术分离的塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160是中国境内新近爆发流行该病的猪群中分离得到的，代表目前国内流行优势毒株，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。本专利技术公开了一种猪塞内加谷病毒分离培养及蚀斑纯化的方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株塞内加谷病毒毒株，其特征在于：该毒株名称为CH‑FJZZ‑2017，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12160。

【技术特征摘要】
1.一株塞内加谷病毒毒株，其特征在于：该毒株名称为CH-FJZZ-2017，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.12160。2.权利要求权利1所述塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160在制备防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗为灭活疫苗。4.一种防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗，其活性成分为经灭活的塞内加谷病毒毒株CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160。5.根据权利要求4所述的防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗，其特征在于：所述防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗包含经灭活的猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160和药学上可接受的佐剂。6.权利要求4或5所述防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)病毒培养：将塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGM...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓战，马洁，巴利民，张国栋，肖进，齐鹏，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11