【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种增强复制能力的鸭坦布苏病毒突变株及其构建与应用。
技术介绍
1、鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属的恩塔亚病毒群，该病毒在1955年首次从马来西亚的蚊子样品中分离到。鸭坦布苏病毒感染导致鸭群采食量骤减、产蛋量严重下降甚至停产，患病鸭精神沉郁、瘫痪、严重者死亡。黄病毒的e蛋白是构成病毒粒子的重要结构蛋白，在病毒吸附与入侵、膜融合过程中发挥重要作用。
2、目前，疫苗免疫仍是防控鸭坦布苏病毒感染最有效的手段，该类疫苗主要是将病毒接种鸭胚制备高病毒滴度抗原，经灭活乳化制备而成。疫苗规模化生产过程会由于鸭胚质量、接种方法、个体差异、收获方法等差异引起抗原质量批间水平产生较大差异，并且逐个接种和收获鸭胚，操作过程繁琐，耗费时间和人力，易造成污染，抗原质量控制困难。因此，有必要将鸭坦布苏灭活疫苗由胚苗转向细胞苗，建立一种生产高效、质量稳定、效价均一的灭活疫苗生产工艺，以确保疫苗产品品质。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供一种鸭坦布苏病毒突变株，该毒株通过鸭坦布苏病毒e蛋白的反向遗传技术，将v196a、n314s两个位点氨基酸突变，有效增强了病毒在bhk-21细胞上的复制能力。
2、具体的，所述所述突变株的鸭坦布苏病毒e蛋白自氨基端的第196位由v(val)突变为a(ala)，第314位由n(asn)突变为s(ser)。
3、鸭坦布苏病毒基因组为单股正链rna，基因组大小约为10990bp，只有一个开放阅读框，共
4、因此，本专利技术人从e蛋白出发，通过一系列实验发现e蛋白的v196a、n314s两个位点氨基酸突变能够增强病毒对bhk-21细胞适应性，增强病毒在细胞中的复制能力，提高病毒滴度。其中，所述鸭坦布苏病毒e蛋白的序列为序列表中序列1，突变后的序列为序列2。
5、在本专利技术一个优选的实施方式中，所述突变株名称为鸭坦布苏病毒qyh-2021-e，已于2023年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为：cgmcc no.24470。
6、本专利技术还提供了所述鸭坦布苏病毒突变株的构建方法，包括以下步骤：构建鸭坦布苏病毒e蛋白的反向遗传系统，使鸭坦布苏病毒e蛋白的v196a、n314s两个位点氨基酸突变。
7、传统的鸭坦布苏病毒鸭胚灭活疫苗制备过程和收获过程复杂，需要大量人力物力，且批间抗原水平不均一，而采用上述方法构建的鸭坦布苏病毒突变株(鸭坦布苏病毒qyh-2021-e)可以提高病毒在bhk-21细胞上的复制能力，为实现胚苗向细胞苗的转换提供基础。
8、在其中一个实施例中，所述构建鸭坦布苏病毒e蛋白的氨基酸突变反向遗传系统，包括以下步骤：
9、引物设计：设计5对可以扩增覆盖鸭坦布苏病毒亲本毒株基因组全长的特异性引物，通过引物引入突变碱基。
10、目的片段的获得：以鸭坦布苏病毒hb株基因组为模板，通过pcr的方法获得5个目的片段，分别命名为p1a、p1b、p1c、p2、p3，之后将目的片段p1a～p1c通过融合pcr方法获得目的片段p1，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并使用凝胶回收试剂盒切胶纯化回收。
11、阳性载体的获得：将3个目的片段分别连接至平末端载体中，将连接产物加入感受态细胞，转化，涂板，37℃培养，挑取单菌落，进行pcr鉴定和基因测序，得到含有正确序列的菌液，提取质粒，得到含有正确序列的阳性载体。
12、全长cdna的构建：通过pcr方法获得3个目的片段，使用凝胶回收试剂盒切胶回收纯化，测得浓度后，以等摩尔比进行融合pcr，使用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收获得全长cdna。
13、采用上述方法，能够利用融合pcr的方法，定点突变目标序列，再通过与载体的连接、转化、提取含有突变序列的阳性质粒，本领域技术人员根据含有突变序列的阳性载体和结构序列，能够通过常规的技术知识制备得到含有突变序列的病毒全长序列的感染性克隆载体。
14、在其中一个实施例中，所述pcr扩增纯化步骤中，所述pcr扩增的反应体系如下所示：其特征在于，所述目的片段的获得步骤中，所述pcr方法如下所示：
15、建立50μl反应体系，具体组分如下：模板，2μl；primer star mix(2x)，25μl，1μl；上游引物，1μl；下游引物，1μl；ddh2o，21μl。振荡混匀后瞬离，进行pcr扩增，反应程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s、52℃退火15s、72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
16、在其中一个实施例中，所述融合pcr步骤中，所述pcr扩增的反应体系如下所示：建立50μl反应体系，具体组分如下：primer star mix(2x)，25μl；各个片段等摩尔比加入；最后加入ddh2o补足至50μl。振荡混匀后瞬离，进行融合pcr，具体反应程序如下所述，第一轮：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸40s，10个循环。结束后，向第一轮pcr产物中加入上下游引物各1μl，进行第二轮pcr，反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s、52℃退火15s、72℃延伸2min30s，30个循环；72℃延伸10min。
17、本专利技术还提供了所述鸭坦布苏病毒突变株(鸭坦布苏病毒qyh-2021-e)在bhk-21细胞中的应用。
18、上述鸭坦布苏病毒突变株(鸭坦布苏病毒qyh-2021-e)增强了在bhk-21细胞中的复制能力，提高病原含量，能够实现将鸭坦布苏病毒由胚苗向细胞苗的转换。
19、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的一种鸭坦布苏病毒突变株qyh-2021-e，该突变株通过突变v196a、n314s两个氨基酸位点，有效降提高了病毒的在bhk-21细胞中的复制能力，且通过pcr实验和测序结果证明突变后的鸭坦布苏病毒突变株(鸭坦布苏病毒qyh-2021-e)可以稳定传代。
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1.一种鸭坦布苏病毒突变株，其特征在于，所述突变株的鸭坦布苏病毒E蛋白自氨基端的第196位由V突变为A，第314位由N突变为S。
2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒突变株，其特征在于，所述鸭坦布苏病毒E蛋白的序列为序列表中序列1，突变后的序列为序列2。
3.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒突变株，其特征在于，所述突变株的全基因组cDNA序列为序列表中序列4。
4.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒突变株，其特征在于，该鸭坦布苏病毒突变株名称为鸭坦布苏病毒QYH-2021-E，已于2023年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.24470。
5.权利要求1所述鸭坦布苏病毒突变株的制备方法，其特征在于，将鸭坦布苏病毒E蛋白自氨基端的第196位由V突变为A，第314位由N突变为S，构建得到复制能力提高的鸭坦布苏病毒突变株。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述构建复制能力提高的鸭坦布苏病毒突变株的方法采用反向遗传系统，包括以下步骤：
7.根据权利要求
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述目的片段的获得步骤中，所述PCR方法如下所示：
9.权利要求1-3中任意一项所述的鸭坦布苏病毒突变株增强鸭坦布苏病毒在BHK-21细胞中复制能力中的应用。
10.权利要求4-8中任意一项所述的方法在增强鸭坦布苏病毒在BHK-21细胞中复制能力中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种鸭坦布苏病毒突变株，其特征在于，所述突变株的鸭坦布苏病毒e蛋白自氨基端的第196位由v突变为a，第314位由n突变为s。
2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒突变株，其特征在于，所述鸭坦布苏病毒e蛋白的序列为序列表中序列1，突变后的序列为序列2。
3.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒突变株，其特征在于，所述突变株的全基因组cdna序列为序列表中序列4。
4.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒突变株，其特征在于，该鸭坦布苏病毒突变株名称为鸭坦布苏病毒qyh-2021-e，已于2023年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：cgmcc no.24470。
5.权利要求1所述鸭坦布苏病毒突变株的制备方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙雪，王增福，吴宗学，李跃，李海鹰，程海波，赵成全，倪娇，史张艳，黄跃强，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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