【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法。
技术介绍
1、葡萄糖醛酸(d-glucuronicacid)，简称葡醛酸(glcua)，分子式c6h10o7，分子量为194.14。葡萄糖醛酸作为一种生物解毒剂，在动物肝脏中能与含有羟基、氨基、羧基、巯基等基团的内源性和外源性有毒物质结合，提高有毒物质的水溶性，最终以葡萄糖醛酸内酯酯、葡萄糖醛酸内酯盐或配合物的形式排出体外，起到解毒作用。然而葡萄糖醛酸在水溶液中极其不稳定，而是以更稳定的葡萄糖醛酸内酯存在的，葡萄糖醛酸内酯，俗称肝泰乐，葡醛内酯作为一种肝脏解毒剂和免疫功能调节剂，是常规的保肝护肝良药；葡醛内酯及其后续产品还是功能性饮料和食品、减肥药、化妆品等的主要添加剂，具有补充体能、改善缺氧、滋养肌肤、延缓衰老的功效，使葡萄糖醛酸内酯每年的需求量递进式增长。
2、传统的葡萄糖醛酸的生产方法主要为多糖水解法和化学氧化催化法。多糖水解法中，连接糖醛酸的苷键一般稳定性高，水解困难，因此水解过程需要用强酸碱，而在强酸碱条件下产物葡萄糖醛酸往往被分解，存在氧化选择性差、副产物多且产品收率低等缺陷，不能满足生产需要。而化学氧化催化法总收率较低(约10％)且存在能耗高、选择性差、环境污染严重等缺陷，使得该方法仍不能满足生产需求。随着人们对微生物认识的提高，生物催化法生产葡萄糖醛酸内酯的研究日益增多，例如：人类羊膜中存在udp-葡萄糖脱氢酶，可以催化udp-葡萄糖生成udp-葡萄糖醛酸，udp-葡萄糖醛酸在相关酶的作用下进一步合成葡萄糖醛酸。相较于
3、肌醇氧化酶是促进肌醇转化为葡萄糖醛酸的一种酶，然而该酶稳定性较差，容易导致转化过程中会发生转化不完全的现象，最终导致以肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸时产生产物浓度和转化率偏低的问题。因此针对上述问题有必要开发一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，利用该工艺方法可以提高葡萄醛酸产品的产量、收率和纯度。
2、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
3、一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，所述工艺方法是指将肌醇料液和固定化肌醇氧化酶搅拌混合，得到的反应料液调ph，控制反应温度和时间，反应结束后的料液经过滤、脱色、浓缩后得到的浓缩液加入浓磷酸后反应、再浓缩、降温结晶、过滤得到葡萄糖醛酸内酯产品。
4、作为一种改进的技术方案，所述肌醇料液的浓度为3-10wt％，所述固定化肌醇氧化酶的用量为3-10％w/v。
5、作为一种改进的技术方案，反应结束后的过滤时先采用料液孔径为20-100nm的陶瓷膜过滤，然后再采用孔径为5000-10000da的超滤膜过滤；脱色处理时，将超滤膜过滤后收集的滤液按照1-4bv/h的流速进入阳离子树脂柱中，然后将流出液以4-6bv/h的流速进入脱色树脂柱，收集的脱色液先采用孔径为100-300da的纳滤膜进行一次浓缩，收集的浓缩液再在温度50-70℃，真空度＜-0.090mpa的条件下进行二次浓缩，得到固含量55-65wt％的浓缩液，然后再按固含量的10-30wt％的量加入浓磷酸，在55-65℃的条件下内酯化0.5-1.5h，得到的料液经过浓缩得到固含量为90-100wt％的浓缩液，然后再以1-5℃/h的速度降温至15-20℃，进行抽滤，洗涤，得到葡萄糖醛酸内酯。
6、作为一种改进的技术方案，所述反应料液调ph至6.5-7.5，反应温度为30-40℃，反应时间为3-5h。
7、作为一种改进的技术方案，所述固定化肌醇氧化酶的制备方法包括以下步骤：
8、(1)将重组大肠基因工程菌通过发酵后的发酵液，经过破碎处理后加入磷酸氢二钠和氯化钙，搅拌、调ph、过滤，收集的粗酶液备用；
9、(2)取步骤(1)中粗酶液，经过浓缩后的浓缩液进入重力纯化柱，采用洗脱剂进行洗脱后，得到纯化酶液；
10、(3)取步骤(2)中所述纯化酶液，加入聚乙烯醇和海藻酸钠的混合液，搅拌混合后的料液再滴加入氯化钙硼酸饱和溶液中，静置一段时间后经过洗涤，然后再加入戊二醛溶液，经过一段时间的交联后再洗涤，得到固化肌醇氧化酶。
11、作为一种改进的技术方案，步骤(1)中所述磷酸二氢钠的加入量为3-5‰w/v，所述氯化钙的加入量为1-5‰w/v，且调ph至6-8后加入3-10％w/v的硅藻土，过滤。
12、作为一种改进的技术方案，步骤(2)中所述粗酶液采用孔径范围为50000-100000da的中空纤维膜进行浓缩。
13、作为一种改进的技术方案，步骤(2)中所述重力纯化柱的填料为葡聚糖凝胶，所述浓缩液按照1-3bv/h的流速进入树脂柱中，所述洗脱剂为0.1-0.5mol/l的咪唑的磷酸盐缓冲盐溶液，且按照0.5-2.5bv/h的流速洗脱所述重力纯化柱。
14、作为一种改进的技术方案，步骤(3)中分别将6-10wt％的聚乙烯醇溶液和1-5wt％的海藻酸钠溶液，然后按照1:1的比例混合得到的混合液与所述纯化酶液按照体积比1-5:1的比例混合，再滴加入3-4.5wt％的氯化钙硼酸饱和溶液中，2-10℃静置20-30h，分别采用磷酸盐缓冲液和纯化水洗涤3次，再加入0.02wt％-0.05wt％的戊二醛溶液，在25-35℃的条件下交联0.5-1.5h，再采用磷酸盐缓冲液和纯化水分别洗涤3次。
15、采用了上述技术方案后，本专利技术的有益效果是：
16、(1)本专利技术制备固定化酶的条件比较温和，且酶的固定化率高。
17、(2)通过本专利技术制备的固定化酶，其固定化酶转化肌醇的效率高，转化时间比较短，产品易于分离，转化后色素比较少。
18、(3)通过该工艺制备的葡萄糖醛酸内酯的纯度与收率比未固定的酶液制备出来的高，工艺步骤比较简单，降低成本，为后续的生产提供一定的理论基础。
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1.一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，所述工艺方法是指将肌醇料液和固定化肌醇氧化酶搅拌混合，得到的反应料液调pH，控制反应温度和时间，反应结束后的料液经过滤、脱色、浓缩后得到的浓缩液加入浓磷酸后反应、再浓缩、降温结晶、过滤得到葡萄糖醛酸内酯产品。
2.根据权利要求1所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，所述肌醇料液的浓度为3-10wt％，所述固定化肌醇氧化酶的用量为3-10％w/v。
3.根据权利要求1所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，所述反应料液调pH至6.5-7.5，反应温度为30-40℃，反应时间为3-5h。
4.根据权利要求1所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，反应结束后的过滤时先采用料液孔径为20-100nm的陶瓷膜过滤，然后再采用孔径为5000-10000Da的超滤膜过滤；脱色处理时，将超滤膜过滤后收集的滤液按照1-4Bv/h的流速进入阳离子树脂柱中，然后将流出液以4-6BV/h的流速进入脱色树
5.根据权利要求1所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，所述固定化肌醇氧化酶的制备方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，步骤(1)中所述磷酸二氢钠的加入量为3-5‰w/v，所述氯化钙的加入量为1-5‰w/v，且调pH至6-8后加入3-10％w/v的硅藻土，过滤。
7.根据权利要求5所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，步骤(2)中所述粗酶液采用孔径范围为50000-100000Da的中空纤维膜进行浓缩。
8.根据权利要求5所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，步骤(2)中所述重力纯化柱的填料为葡聚糖凝胶，所述浓缩液按照1-3BV/h的流速进入树脂柱中，所述洗脱剂为0.1-0.5mol/L的咪唑的磷酸盐缓冲盐溶液，且按照0.5-2.5BV/h的流速洗脱所述重力纯化柱。
9.根据权利要求5所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，步骤(3)中分别将6-10wt％的聚乙烯醇溶液和1-5wt％的海藻酸钠溶液，然后按照1:1的比例混合得到的混合液与所述纯化酶液按照体积比1-5:1的比例混合，再滴加入3-4.5wt％的氯化钙硼酸饱和溶液中，2-10℃静置20-30h，分别采用磷酸盐缓冲液和纯化水洗涤3次，再加入0.02wt％-0.05wt％的戊二醛溶液，在25-35℃的条件下交联0.5-1.5h，再采用磷酸盐缓冲液和纯化水分别洗涤3次。
...【技术特征摘要】
1.一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，所述工艺方法是指将肌醇料液和固定化肌醇氧化酶搅拌混合，得到的反应料液调ph，控制反应温度和时间，反应结束后的料液经过滤、脱色、浓缩后得到的浓缩液加入浓磷酸后反应、再浓缩、降温结晶、过滤得到葡萄糖醛酸内酯产品。
2.根据权利要求1所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，所述肌醇料液的浓度为3-10wt％，所述固定化肌醇氧化酶的用量为3-10％w/v。
3.根据权利要求1所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，所述反应料液调ph至6.5-7.5，反应温度为30-40℃，反应时间为3-5h。
4.根据权利要求1所述的一种利用固定化肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸内酯的工艺方法，其特征在于，反应结束后的过滤时先采用料液孔径为20-100nm的陶瓷膜过滤，然后再采用孔径为5000-10000da的超滤膜过滤；脱色处理时，将超滤膜过滤后收集的滤液按照1-4bv/h的流速进入阳离子树脂柱中，然后将流出液以4-6bv/h的流速进入脱色树脂柱，收集的脱色液先采用孔径为100-300da的纳滤膜进行一次浓缩，收集的浓缩液再在温度50-70℃，真空度＜-0.090mpa的条件下进行二次浓缩，得到固含量55-65wt％的浓缩液，然后再按固含量的10-30wt％的量加入浓磷酸，在55-65℃的条件下内酯化0.5-1.5h，得到的料液经过浓缩得到固含量为90-100wt％的浓缩液，然后再以1-5℃/h的速度降温至15-20℃，进行抽滤，洗涤，得到葡萄糖醛酸内...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱理平，徐良平，邱崇顺，
申请(专利权)人：诸城市浩天药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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