本发明专利技术涉及生物检测技术领域，公开一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。本发明专利技术通过截取鸡传染性支气管炎病毒保护性抗原S蛋白的胞外区，构建含有S胞外区基因的穿梭载体，转染sf9昆虫细胞，拯救重组病毒，并通过hi5细胞进行分泌表达，通过亲和层析进行纯化，获得S蛋白抗原。本试剂盒使用昆虫细胞表达系统表达的蛋白包被酶标板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体。本发明专利技术试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场应用前景。场应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。
技术介绍
[0002]鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，AIB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，引起呼吸道、肾脏和生殖道等部位产生病理变化，致使感染发病鸡饲料报酬比降低、产蛋率低而造成巨大经济损失。IBV对所有品种、各年龄段和不同性别的鸡均有易感性，特别是4周龄前的雏鸡最易发病。
[0003]IBV是一种变异性很强的冠状病毒，传播迅速，血清型众多，不同血清型之间缺乏交叉保护作用。IBV基因组由结构蛋白和非结构蛋白组成，结构蛋白分别由纤突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、小包膜蛋白(Small Envelope，E)和核蛋白(Nucleocapsid，N)组成，这些结构蛋白在病毒吸附、复制和转录过程发挥不同的作用。S蛋白由S1和S2两种蛋白组成，S1蛋白暴露后可诱导机体产生中和病毒的抗体以及血凝抑制抗体，因此，S1蛋白是IBV最主要的免疫原。
[0004]疫苗免疫是预防和控制IB发生的最有效方法，主要以接种灭活和弱毒疫苗为主，弱毒疫苗的免疫效果优于灭活疫苗，而免疫后抗体水平的高低可直接对疫苗的免疫效果进行评价，并直接关系到免疫鸡群对鸡传染性支气管炎病毒的抵抗力。因此，快速准确的检测鸡群中抗体水平，对了解鸡群中IB的流行情况、适时调整免疫程序，有效预防IB的流行具有重要意义。
[0005]在IBV抗体检测上，酶联免疫吸附试验(ELISA)因其简单、敏感、高效、经济、适于大规模使用等特点广泛被应用。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于检测鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒利用鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白S抗原作为包被抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，用于检测鸡血清中是否含有鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体。
[0007]本专利技术提供一种鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原，所述结构蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还提供，编码上述结构蛋白抗原的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供含有上述核苷酸序列的生物材料，所述生物材料包括表达盒、重组载体、昆虫细胞；所述重组载体为质粒或病毒载体。
[0010]根据本领域技术人员的理解，本专利技术还请求保护，上述的结构蛋白抗原或上述的
核苷酸序列或上述的生物材料在检测鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体或制备鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白检测试剂盒中的应用。
[0011]本专利技术提供一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗；所述酶联反应板包被抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述鸡传染性支气管炎病毒S蛋白溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔100ng抗原，2～8℃放置8～12小时，使抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
[0013]所述阳性对照血清为所述鸡传染性支气管炎病毒人工感染后采集的鸡血清；所述阴性对照血清为无特定病原体(SPF)(无鸡传染性支气管炎病毒病原体)的鸡血清。
[0014]所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡IgG抗体。
[0015]在本专利技术提供的鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒中，所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为四甲基联苯胺溶液，使用时，底物液A与底物液B以1:1的比例混合；所述终止液为硫酸溶液。
[0016]具体地，所述底物液A为含0.06％(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
[0017]所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5％(g/100ml)酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween
‑
20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
[0018]本专利技术还提供上述鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括：平衡、配液、设定、待测标本预稀释、加样、温育、洗板、加酶、温育、洗板和显色。
[0019]在本专利技术提供的使用方法中，阴性对照OD
450nm
平均值应该≤0.15，否则无效；阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效；临界值＝0.17
×
阳性对照OD
450nm
值平均值；
[0020]待测样本测定的OD
450nm
值≥临界值者判为阳性；待检样本测定的OD
450nm
值<临界值者判为阴性。
[0021]本专利技术还提供鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原的制备方法，本专利技术所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备鸡传染性支气管炎病毒的保护性抗原。本专利技术所述的昆虫细胞为sf9和hi5细胞。
[0022]本专利技术所提供的制备方法，包括：将SEQ ID NO.2所述的基因序列进行人工合成目的基因片段，通过同源重组方式连至pFastBac1载体中，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性穿梭载体，将穿梭载体转化到DH10Bac感受态细胞，蓝白斑筛选阳性重组Bacmid；
[0023]阳性Bacmid转染无血清悬浮培养的sf9细胞，收获培养上清，即为P0代病毒；向sf9细胞按1％
‑1‰
比例接种P0代重组杆状病毒，获得P4或P5代病毒；向hi5细胞按1％
‑1‰
比例接种P4或P5代病毒；
[0024]收集细胞上清，水性滤膜过滤，细胞上清结合His柱，洗脱后获得鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原；
[0025]作为本专利技术的一个具体实施方式，本专利技术提供的鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白抗原的制备方法，包括：
[0026](1)截取其胞外区21
‑
569位氨基酸基因序列，所得序列如SEQ IDNO.2所述，将SEQ ID NO.2所述的基因序列进行人工合成，合成的目的基因片段，通过同源重组方式连至pFastB本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白，其特征在于，所述结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述结构蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.含有权利要求2所述核苷酸序列的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、重组载体、昆虫细胞；所述重组载体为质粒或病毒载体。4.权利要求1所述的结构蛋白或权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的生物材料在检测鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白抗体或制备鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白检测试剂盒中的应用。5.一种鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗；所述酶联反应板包被抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。6.权利要求5所述鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述结构蛋白溶于碳酸盐溶液，然后加到酶联反应板，2～8℃放置8～12小时，使抗原与酶联反应板充分结合，向反应孔中加入含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液，封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后保存。7.权利要求5所述的鸡传染性支气管炎S蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：平衡、配液、设定、待测标本预稀释、加样、温育、洗板、加酶、温育、洗板和显色。8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，阴性对照OD
450nm
【专利技术属性】
技术研发人员：李翠霞，王飞，李京京，付金玉，侯旭，崔松奇，肖进，董春娜，张蕾，程海波，赵成全，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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