设计改良稳定的融合前体猪腹泻病毒S蛋白及其应用制造技术

本申请公开了在蛋白质三维结构基础上对猪流行性腹泻病毒的棘突S蛋白进行的设计改良，通过对其特定位点的氨基酸残基进行脯氨酸、半胱氨酸等突变以及剪切替换，增强了S蛋白融合前体三聚体构象和抗原的稳定性，提高了重组蛋白的表达量和均一性。做为疫苗或者疫苗组分使用时免疫原性增加，能够诱导受免疫动物产生较高水平的中和抗体。本申请还包括了编码和表达改良S蛋白突变体的载体，也可以是含此类重组蛋白的组合物及其应用。重组蛋白的组合物及其应用。重组蛋白的组合物及其应用。

【技术实现步骤摘要】
设计改良稳定的融合前体猪腹泻病毒S蛋白及其应用


[0001]本申请涉及生物医药领域，具体的涉及改良的猪流行性腹泻病毒S蛋白的突变体及其应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。猪流行性腹泻病毒最初在英格兰被确认(Wood,1977)。2010年冬天，猪流行性腹泻在中国的华南养猪场开始爆发，随即传遍全国。该病在南方造成超过100万头仔猪死亡，对养猪业造成毁灭性破坏。即使是接种过疫苗的乳仔猪也未能幸免，死亡率几乎为100％(Li等人，2012；Sun等人，2012；Wang等人，2013)。在一项2011年2月至2014年3月进行的流行病学调查过程中，发现中国29个省报告了PEDV疫情，其中除西藏和海南外，PEDV阳性率71.43％
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83.47％(Zhang et al.,2014；Feng,2014)。随着灭活或减毒二价中国PEDV疫苗的广泛使用，到2010年10月，PE D在全国的传播得到了有效控制，但是随后，当出现新的变异毒株时PEDV感染又急剧增加，严重危害了养猪行业。该病的流行特点及其流行现状与猪传染性胃肠炎(TGE)非常的相似，但与TGE无血清学交叉反应。
[0003]猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒中的阿尔法属，病毒具有囊膜包被。直径大小约为95
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190nm，包含约18nM的刺突。基因组为约28kb的正单链RNA，靠近3
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端5kb区域内含有5个主要的开放阅读框(ORF)，编码4种结构蛋白：(1)S蛋白(spike protein)，(2)sM蛋白(small membrane protein)，(3)M蛋白(membrane protein)和(4)N蛋白(nucleoprotein)。位于sM基因上游的开放阅读框(ORF)，被命名为0RF3，编码第五个未知功能且具有多态性的产物。遗传变异可能性较大的是S基因，S基因编码猪流行性腹泻病毒的囊膜表面的刺突糖蛋白，是约180至200kDa分子量的S蛋白。S蛋白属于I类融合蛋白(Bosch等，2003)。功能性S蛋白单体在病毒颗粒表面形成同源三聚体，每个单体由S1和S2两个亚基组成，能够被宿主蛋白酶酶切成N端的S1亚基和C端膜锚定的S2亚基。S1亚基承担识别宿主细胞表面的受体并与之结合，S2亚基在病毒与宿主细胞膜发生融合的过程中发挥重要作用(Park等，2007；de Haan等，2004)。猪流行性腹泻病毒，新型冠状病毒(SARS
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CoV2)，严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
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CoV)、非融合性MHV
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2和HCoV
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229E的S蛋白没有弗林蛋白酶识别位点，这些蛋白在其初始产生过程中不会被酶切(Simmo ns et al.,2004；Matsuyama等人，2004；Yoshikura等人，1988；Shirato等人，2011)。当这些病毒与宿主细胞受体结合，就会被运送到胞内体，由胞内体蛋白酶酶切，例如组织蛋白酶，以及由低pH环境激活的其他蛋白酶(Shirato等，2011)。在那里S蛋白亚基被酶切并激活，启动S蛋白三聚体从融合前体(Prefusion)向融合后体(Post
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fusion)发生不可逆的构象变化，导致病毒基因组从胞内体释放到细胞质中(Shirato等人,2011)，完成病毒的侵染并开始病毒的增殖。
[0004]综上所述，猪流行性腹泻病毒囊膜表面的融合前体S蛋白在病毒识别和侵染过程中承担着重要作用。同时作为病毒颗粒的主要表面糖蛋白，是宿主中和抗体的主要目标
(Okda等人，2017)，也是开发生产猪流行性腹泻病重组蛋白疫苗重要靶点。但是，由于亚稳态的融合前构象S蛋白在酶切等因素的作用下容易向高度稳定的融合后构象发生不可逆的变化(Bullough等，1994)。这种构象转变已被提出会造成重组蛋白疫苗有效性和稳定性降低。因此，设计改良构象稳定的融合前体S蛋白是开发猪流行性腹泻病重组蛋白疫苗重要方向。
[0005]多年来，已经开发并尝试了许多PEDV疫苗，但都没有取得多大成功。尽管中国、日本和韩国都有针对PEDV的疫苗，但在美国或欧洲还没有批准的疫苗(USDA 2013)。目前市场上有两种类型的PEDV疫苗—灭活疫苗或减毒活疫苗。几家中国、日本和韩国公司生产PEDV疫苗保护效果不佳，对于全球养猪业来说并不容乐观。现有证据表明，PEDV仍在中国不断流行，造成重大经济损失，迫切需要开发更加有效的疫苗。

技术实现思路

[0006]本申请提供了一种猪流行性腹泻病毒的S蛋白突变体，所述S蛋白突变体与野生型病毒S蛋白相比，包含了一个或多个氨基酸突变。所述PEDV S蛋白突变体能够形成三聚体结构并维持在融合前体状态；同时在使用哺乳动物细胞表达目标蛋白时产量大幅提高，产生的蛋白质更加稳定和均一，做为疫苗或者疫苗组分使用时免疫原性增加，能够诱导受免疫动物产生较高水平的中和抗体。本申请所述的PEDV S蛋白突变体能够用于制备猪腹泻重组蛋白疫苗，用于预防和/或治疗PEDV引起或介导的疾病和/或病症。
[0007]一方面，本申请提供了一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)S(Spike)蛋白突变体，所述S蛋白突变体与野生型猪流行性腹泻病毒的S蛋白的氨基酸序列相比，包含一个或多个氨基酸位点突变。
[0008]所述的PEDV S蛋白突变体包含下述性质中的一种或多种：
[0009]1)所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的突变体做为疫苗适用于多种PEDV毒株，所述PEDV毒株包括经典毒株1型(1a和/或1b)和/或变异毒株2型(2a、2b和/或2c)；
[0010]2)使所述PEDV S蛋白突变体形成的蛋白三聚体保持融合前体构象；
[0011]3)增加重组表达时三聚体蛋白的产量，稳定性和均一性；
[0012]4)使受免疫动物体内产生较高水平的中和抗体以抑制猪腹泻病毒的侵染。
[0013]在某些实施方式中，所述野生型猪流行性腹泻病毒的S蛋白包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0014]在某些实施方式中，所述PEDV S蛋白突变体包含将一个或多个氨基酸位点突变为脯氨酸(Pro)的氨基酸突变。在某些实施方式中，所述将一个或多个氨基酸位点突变为脯氨酸的氨基酸突变包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：F892P、V1027P、A1028P、I1072P和L1073P。在某些实施方式中，所述突变能够阻断蛋白质阿尔法螺旋结构的贯通。
[0015]在某些实施方式中，所述PEDV S蛋白突变体包含将PEDV S蛋白的一个或多个氨基酸位点突变为半胱氨酸(Cys)的氨基酸突变，所述氨基酸突变能够在S蛋白单体内部形成二硫键，所述氨基酸突变选自下述的一组或多组：
[0016]1)H178C和G424C；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猪流行性腹泻病毒(PEDV)S(Spike)蛋白突变体，所述PEDV S蛋白突变体与野生型猪流行性腹泻病毒的S蛋白的氨基酸序列相比，包含一个或多个氨基酸位点突变，所述PEDV S蛋白突变体具有下述性质中的一种或多种：1)所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的突变体做为疫苗适用于多种PEDV毒株，所述PEDV毒株包括经典毒株1型(1a和/或1b)和/或变异毒株2型(2a、2b和/或2c)；2)使PEDV S蛋白三聚体保持融合前体构象；3)增加PEDV S蛋白三聚体表达的重组蛋白产量，稳定性和均一性；4)使受免疫动物体内产生高水平的中和抗体以抑制猪腹泻病毒的侵染。2.根据权利要求1所述的PEDV S蛋白突变体，其包含将一个或多个氨基酸位点突变为脯氨酸(Pro)的氨基酸突变，所述突变能够阻断蛋白质阿尔法螺旋结构的贯通，使S蛋白保持在融合前体的状态，所述氨基酸突变选自下组中的一个或多个：F892P、V1027P、A1028P、I1072P和L1073P。3.根据权利要求1
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2中任一项所述的PEDV S蛋白突变体，其包含将PEDV S蛋白的一个或多个氨基酸位点突变为半胱氨酸(Cys)的氨基酸突变，所述氨基酸突变能够在S蛋白单体内部形成二硫键，所述氨基酸突变选自下述的一组或多组：1)H178C和G424C；2)T452C和A668C；3)Q1051C和A1089C；4)I1063C和L1082C；5)L1070C和A1075C。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的PEDV S蛋白突变体，其包含在PEDV S蛋白单体之间形成二硫键的氨基酸突变，所述突变选自下述的一组或多组：1)V386C和P501C；2)S537C和S607C；3)S715C和S917C；4)S846C和L1024C；5)N979C和P1181C；6)S1214C。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的PEDV S蛋白突变体，其包含一个或多个糖基化位点修饰，所述糖基化位点修饰包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：T512A、T554A、N167A和N348A。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的PEDV S蛋白突变体，其包含删除部分S蛋白的表面构象不稳定的肽链的氨基酸突变，所述氨基酸突变包含将S877
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K889氨基酸替换为序列为PSSG的四氨基酸的连接子或者将S877
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K889氨基酸替换为序列为GG的二氨基酸的连接子。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的PEDV S蛋白突变体，其包含删除PEDV S蛋白跨膜区的一个至多个氨基酸的突变，所述删除PEDV S蛋白跨膜区的一个至多个氨基酸的突变选自下组中的一种或多种：1)其包含删除自氨基酸I1251至氨基酸Q1382的突变；以及2)其包含删除自氨基酸Y1319至氨基酸Q1382的突变。
8.根据权利要求1
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7中任一项所述的PEDV S蛋白突变体，其包含选自下组的一种或多种氨基酸突变：氨基酸S877至氨基酸K889突变为氨基酸PSSG、氨基酸S877至氨基酸K889突变为GG、T554A、T512A、N166A、N347A、S1214C、V386C、P501C、T452C、A668C、N979C、P1181C、S846C、L1024C、S715C、S917C、H178C、G424C、S537C、S607C、I1072P/C/G、L1073P/C、L1070C、A1075C、I1063C、L1082C、F892P、V1027P、A1028P、Q1051C、A1089C、D1071C、S1074C、删除了自氨基酸Y1319至氨基酸Q1382以及删除了自氨基酸I1251至氨基酸Q1382。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的PEDV S蛋白突变体，其包含选自下述的任一组氨基酸的突变：1)Y1319
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Q1382删除；2)Y1319
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Q1382删除以及S877
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K889突变为PSSG；3)Y1319
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Q1382删除、T554A和T512A；4)Y1319
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Q1382删除、S1214C、T554A和T512A；5)Y1319
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Q1382删除、V386C、P501C、T554A和T512A；6)Y1319
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Q1382删除、T452C、A668C、T554A和T512A；7)Y1319
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Q1382删除、N979C、P1181C、T554A和T512A；8)Y1319
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Q1382删除、S846C、L1024C、T554A和T512A；9)Y1319
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Q1382删除、S715C、S917C、T554A和T...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈磊，赵氏璧，吴超，方涛，王聪，戴敏，苏斌，谢欣，丁晓雅，王得荣，黄佳笛，高腾森，陈莉，陈浩，
申请(专利权)人：易康生物苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：