一种SARS-CoV-2冠状病毒糖基化RBD蛋白及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种SARS

【技术实现步骤摘要】
一种SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白及其制备与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]作为冠状病毒2(SARS
‑
CoV
‑
2)进入宿主细胞的关键因素，Spike(S)蛋白是一种高度糖基化的蛋白质，由S1和S2亚基组成，其在宿主细胞识别(S1)和病毒宿主细胞膜融合(S2)中起作用。S1亚基上的受体结合域(RBD，319
‑
541个残基)与人类ACE2(hACE2)受体直接接触，在病毒感染的过程中发挥重要作用。因此，它是引起人类免疫应答的最具吸引力的抗原，也是治疗药物、中和抗体和疫苗开发的主要目标。在RBD中，已经确定了两个N
‑
糖基化位点(N331，N343)和多个O
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糖基化位点，在与hACE2的结合中起着关键作用。
[0003]重组RBD蛋白已被用于候选的疫苗或治疗药物，多个相关产品已经上市或处于不同的临床阶段。实验证实，不同的糖基化修饰会影响重组蛋白稳定性和治疗效果。因此，寻找具有更优的糖基化修饰的RBD蛋白作为SARS
‑
CoV
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2的候选疫苗或治疗性糖蛋白药物具有重要的理论意义和应用价值，成为目前研究的热点。检索表明：关于Tn(GalNAc
‑
)修饰的RBD蛋白及其体外糖基化的制备方法和作为新冠病毒候选疫苗或抗病毒药物的应用在国内外还未见相关报道。
[0004]
技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白及其制备方法与应用，该SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白在预防或治疗新型冠状病毒感染方面具有潜在的重要作用。
[0006]本专利技术所述的SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白，其特征在于：所述糖基化RBD蛋白简称Tn
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RBD，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示冠状病毒S蛋白的RBD结构域在其T323，T345和S514位修饰结合上GalNAc残基组成，其中Thr323糖基化位点的Tn糖基化修饰为100％，Thr345糖基化位点的Tn糖基化修饰为7.95％，Ser514糖基化位点的Tn糖基化修饰为2.56％。
[0007]上述SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白的制备方法，步骤是：
[0008](1)使用常规方法制备获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBD结构域蛋白；
[0009]其中，包括将编码所述RBD结构域的核苷酸序列克隆入大肠杆菌表达载体，而后将该载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中进行表达和纯化；在表达和纯化时，末端添加纯化标签，可以进行可溶性或包涵体形式的表达与纯化。
[0010](2)以RBD结构域蛋白为底物，利用人N
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乙酰氨基半乳糖转移酶GalNAc
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T通过体外糖基化修饰方法合成Tn
‑
RBD；其中，合成步骤是：
[0011]1)按照终浓度计，在含有RBD结构域蛋白0.8～1.0mg/mL，UDP
‑
GalNAc 3～10mM，
MnCl
2 10mM，pH 7.0～8.0的10～300mM Tris缓冲液的反应体系中，加入2～10μg/mL的人N
‑
乙酰氨基半乳糖转移酶GalNAc
‑
T；
[0012]2)然后置30
‑
37℃水浴条件下，反应时间4h后,补加终浓度为3～10mM UDP
‑
GalNAc，继续反应4～40h；
[0013]3)反应结束后，使用凝胶层析纯化得到GalNAc
‑
修饰的糖基化RBD蛋白Tn
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RBD。
[0014]上述制备方法中，优选的实施方式是：步骤(2)所述合成步骤是1)按照终浓度计，在含有RBD结构域蛋白1.0mg/mL，UDP
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GalNAc 5mM，MnCl
2 10mM，pH 7.5的25mM Tris缓冲液的反应体系中，加入5μg/mL的人N
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乙酰氨基半乳糖转移酶GalNAc
‑
T；2)然后置37℃水浴条件下，反应时间4h后,补加终浓度为5mM UDP
‑
GalNAc，继续反应4h；3)反应结束后，使用豌豆凝集素VVA/VVL凝胶层析纯化得到Tn
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RBD。
[0015]本专利技术所述SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白在制备抗SARS
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CoV
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2冠状病毒药物中的应用。
[0016]本专利技术所述SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白在利用氢氧化铝佐剂制备抗SARS
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CoV
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2冠状病毒亚单位疫苗中的应用。
[0017]本专利技术提供的SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白，是通过体外糖基化的方法制备的Tn(GalNAc
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)修饰的RBD蛋白(Tn
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RBD)，其具有制备工艺路线简单，纯化方便，回收率高，纯度高的特点；纯化后蛋白样品可以作为疫苗原液，与佐剂一起制备成疫苗成品且其免疫产生的抗体对RBD与hACE2结合的抑制能力明显增强。检索表明：关于Tn(GalNAc
‑
)修饰的RBD蛋白作为新冠病毒候选疫苗的应用在国内外还未见相关报道。本专利技术为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便的方法，具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
[0018]图1为纯化的RBD蛋白结构域SDS
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PAGE电泳分析图。
[0019]图2为GalNAc
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T催化合成RBD蛋白结构域糖基化水平的Western blot分析图。
[0020]A)anti
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His抗体进行的Western Blot分析图；B)使用VVA
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Biotin进行Lectin Blot分析图；其中泳道1为纯化的非糖基化RBD蛋白结构域；泳道2为GalNAc
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T催化合成的Tn
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RBD蛋白结构域。
[0021]图3为GalNAc
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T催化合成RBD蛋白结构域糖基化水平的MALDI
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TOF分析图。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白，其特征在于：所述糖基化RBD蛋白简称Tn
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RBD，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示冠状病毒S蛋白的RBD结构域在其T323，T345和S514位修饰结合上GalNAc残基组成，其中Thr323糖基化位点的Tn糖基化修饰为100％，Thr345糖基化位点的Tn糖基化修饰为7.95％，Ser514糖基化位点的Tn糖基化修饰为2.56％。2.权利要求1所述SARS
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CoV
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2冠状病毒糖基化RBD蛋白的制备方法，步骤是：(1)使用常规方法制备获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBD结构域蛋白；(2)以RBD结构域蛋白为底物，利用人N
‑
乙酰氨基半乳糖转移酶GalNAc
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T通过体外糖基化修饰方法合成Tn
‑
RBD；其中，合成步骤是：1)按照终浓度计，在含有RBD结构域蛋白0.8～1.0mg/mL，UDP
‑
GalNAc 3～10mM，MnCl
2 10mM，pH 7.0～8.0的10～300mM Tris缓冲液的反应体系中，加入2～10μg/mL的人N
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乙酰氨基半乳糖转移酶GalNAc
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T；2)然后置30
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37℃水浴条件下，反应时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔蕴，王圣钧，荣永恒，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：