一种多肽、免疫原、疫苗和用途制造技术

本发明专利技术属于生化领域，公开了一种多肽，所述多肽具有：(I)、如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2任一所示的氨基酸序列；或(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有80％以上相似性的氨基酸序列。该多肽具有较强的免疫能力，同时，氨基酸长度不超过12个；具有成本低、制备简单的优势。同时，本发明专利技术还公开了一种免疫原、疫苗和用途。途。

【技术实现步骤摘要】
一种多肽、免疫原、疫苗和用途


[0001]本专利技术涉及生化领域，具体为一种多肽、免疫原、疫苗和用途。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻病毒(PEDV)是Nidovirales目冠状病毒科α冠状病毒属的一种病毒，可引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率。其RNA与核衣壳(N)蛋白包裹，病毒粒子包被由膜(M)、被膜(E)和棘突(S)三种结构蛋白组成。2010年，中国报告了PEDV的S缺失的新型病毒株在全国范围内迅速传播，造成重大经济损失。中国的猪流行性腹泻(PED)是由PEDV的两个不同基因组引起的，PEDV流行毒株S突变株主要由S蛋白的S1亚单位中含有多个缺失和插入导致；经典毒株是S蛋白非突变的病毒菌株。
[0003]当前，仍然没有防治PED的有效药物，疫苗接种仍然是防控PED的最主要手段。到目前为止，各国学者做了大量PED疫苗研究工作，并研发出传统的灭活、减毒疫苗到亚单位、活载体(腺病毒及腺相关病毒表达抗原)、转基因植物疫苗以及核酸疫苗等，这些疫苗在PEDV的预防中均发挥着重要作用。S蛋白是一种多功能分子装置，负责特定宿主和组织的识别和诱导保护性体液和细胞免疫，以中和和清除病毒。PEDV S蛋白分为S1和S2两个结构域，其中S1结构域介导受体结合，S2结构域负责膜融合。尽管在许多冠状病毒中观察到S1
‑
NTD的唾液酸结合活性并促进病毒复制，但S1
‑
NTD对于传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)和PEDV的一些突变株是可有可无的(Schwegmann
‑
>Wessels,2014；Suzuki，2016；Hou,2017)。早期对PEDVS蛋白抗原区域内研究发现含有大量的中和抗体结合位点，全蛋白或大量的抗原表位在空间形成位阻作用，不利于表位和受体的结合；其次，不准确的表位，在体内表达容易让机体产生更多的炎症和不必要的刺激；最后抗原表位应具有很好的亲和力，通过有力的结合，表位在空间消耗最低的能量，抗原蛋白表达更稳定，更长时间的存在。一个长的核心抗原表位COE(499
‑
638aa)和3个线性表位(SS2，
748
YSNIGVCK
755
；SS6，
764
LQDGQVKI
771
；2C10，
1368
GPRLQPY
1374
)。但由于PEDV通过极高的突变率和糖基化位点来进行免疫逃逸，所以针对PEDV的疫苗保护效果不佳。此外，全病毒免疫处理方式复杂，成本相对合成肽疫苗也是比较高的。
[0004]为了解决该问题，有人试图通过述S蛋白的多个截短片段连接形成免疫原，如D1:CN113292659A提供一种重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物。重组蛋白是由来自猪流行性腹泻病毒S蛋白(Spike，纤突蛋白)的截短片段与猪IgG的Fc片段串联而成的融合蛋白，S蛋白的截短片段优选选自S蛋白的S1亚基中具有唾液酸结合活性的N端结构域(NTD)、中和表位域(COE)以及S2亚基中的多个B细胞识别表位。疫苗组合物包含了重组蛋白以及佐剂。本专利技术的重组蛋白免疫小鼠后能够产生较高水平的IgG抗体和中和抗体滴度，CD
3+
CD
4+
、CD
3+
CD
8+
淋巴细胞比例和淋巴细胞中IFN
‑
γ、IL
‑
4浓度均表现出显著升高。
[0005]这种方法需要将多个多肽连接在一起才能表现出较好的免疫性能。
[0006]D2：CN113490508A公开了猪流行性腹泻(PED)病毒疫苗组合物及其制备方法，其具体公开了一种包含由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的猪流行性腹泻(PED)病毒蛋白；包含
该猪流行性腹泻(PED)病毒蛋白的疫苗组合物等。
[0007]根据其氨基酸序列记载可以得知，该多肽的长度达到了760个氨基酸。
[0008]D3：CN111607615A一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎病毒病二联亚单位疫苗的制备方法的
技术介绍
记载：猪流行性腹泻和传染性胃肠炎亚单位疫苗的研究一直集中在S1蛋白的表达和疫苗研究(如中国专利申请号为201610348237.8的专利技术专利中使用昆虫杆状病毒表达S1区21
‑
789位的蛋白)，以及将S蛋白的核心区域的串联表达(如中国专利申请号为201610256701.0的专利技术专利中使用大肠杆菌串联表达S蛋白的3个核心区域)，仅仅使用截短或者不完全的S蛋白作为抗原，存在抗原表位不全、免疫原性差等不足之处，导致免疫保护力度不够。近年来，也有将S蛋白完整表达(如中国专利申请号为CN201810310540.8的专利技术专利中使用CHO细胞表达PEDV的S全长蛋白)，以及二联疫苗(如中国专利申请号为CN201710341489.2的专利技术专利中使用PEDV的S1和TGEV的S蛋白核心区域的串联表达)或三联疫苗(如中国专利申请号为CN201711093087.1的专利技术专利中通过三次培养分别生产三种病毒的S1蛋白)，但一次培养即可生产这两种病毒亚单位疫苗的方法，还未见报道。
[0009]在该专利技术中的有益效果部分记载：利用T2A多肽的自裂解特性，将PEDV和TGEV的S蛋白全长序列用T2A多肽串联起来，同时替换各自的信号肽为杆状病毒信号肽GP64，前体蛋白经裂解，信号肽引导到达内质网，经一系列翻译后加工修饰，形成2个成熟的S蛋白分泌表达到胞外。昆虫细胞拥有完备的翻译后加工修饰系统，使PEDV和TGEV的S蛋白形成具有良好抗原性的病毒样颗粒。PEDV和TGEV的S蛋白预测分子量分别为150kDa和157kDa，经糖基化修饰，实际分子量大于一般蛋白表达的分子量上限，蛋白分泌到培养基后的降解成为制约生产的瓶颈。本专利技术在培养基中添加水解乳蛋白和酵母提取物，通过增加外源蛋白，降低目的蛋白在培养物中的比例；同时在培养过程中添加多种蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，两步并举防止蛋白酶降解目的蛋白。
[0010]可见，上述对比文件提供的猪流行性腹泻病毒免疫方法可大致分为以下几种：
[0011]1.S蛋白全长表达；
[0012]2.取S蛋白上的多个短链多肽串联；
[0013]3.取S蛋白上中等长度的多肽进行表达，这里的中等长度最少都是100起步。
[0014]上述方案存在的制备复杂、可能存在免疫逃逸、成本高昂的问题。
[0015]所以本案解决的核心问题是：如何简化多肽，同时具有较强的免疫能力。

技术实现思路

[0016]本专利技术的目的在于提供一种多肽，该多肽具有较强的免疫能力，同时，氨基酸长度不超过12个；具有成本低、制备简单的优势。同时，本专利技术还公开了一种免疫原、疫苗和用途。
[0017]本专利技术不作特殊说明的情况下：mM代表毫摩尔/升，nM代表纳摩尔/升；
[0018]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种多肽，所述多肽具有：
[0019](I)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽具有：(I)、如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2任一所示的氨基酸序列；或(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有80％以上相似性的氨基酸序列。2.一种免疫原，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：格日勒图，张斌，刘芳，刘志成，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：