鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，公开了鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法

【技术实现步骤摘要】
鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法


[0001]本专利技术属于兽用生物制品
，具体地说，涉及鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法
。

技术介绍

[0002]鸭坦布苏病毒
(Duck Tembusu virus
，
DTMUV)
是一种新型黄病毒，能够引起鸭
、
鹅等水禽以出血性卵巢炎为主要病变特证的急性
、
烈性传染病，称之为鸭坦布苏病
。
鸭坦布苏病毒能够引起多品种
、
不同日龄鸭发病，一年四季均可发病，尤其
10
～
25
日龄幼鸭更易感
。
该病发病率达
80
％以上，死亡率2％～
10
％
。
蚊
、
虫和野鸟类为重要的传播媒介，污染的粪污
、
饲料
、
饮水
、
器具
、
运输工具等可以造成大范围快速传播，此外，鸭坦布苏病毒可经卵由母鸭垂直传播给雏鸭
。
[0003]研究人员已经从鸡
、
麻雀等陆禽中分离到该病毒，表明鸭坦布苏病毒宿主范围进一步扩大，该新型黄病毒潜在危害巨大
。
目前鸭坦布苏病毒病活疫苗和灭活疫苗已成为防控该传染病的主要路径，该类疫苗主要是将病毒接种鸭胚或鸭胚成纤维细胞
(DEF)
制备高病毒滴度抗原，经真空冻干或灭活乳化制备而成
。
>疫苗规模化生产过程会由于鸭胚原材料质量
、
接种方法
、
个体孵育差异
、
收获方法
、DEF
生长状态等差异引起抗原质量波动，批间抗原水平会出现不均一且逐胚
/
瓶接种
、
收获等抗原生产工艺比较繁琐，操作过程中容易造成细菌污染，人力
、
物力资源投入巨大
、
抗原质量控制困难
。
[0004]为了生产高效
、
均一
、
稳定的批间抗原产品，有必要建立一种新型的鸭坦布苏病毒抗原的生产工艺，稳定抗原质量
、
保证抗原效价，确保疫苗产品品质
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法
。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，所述方法包括如下步骤：
[0007](1)
取
LMH
细胞经复苏后加入到无血清培养基中进行悬浮培养，当细胞长至
2.0
×
106～
4.0
×
106cells/mL
，活率在
90
％以上时，作为用于接种鸭坦布苏病毒的培养基质；
[0008](2)
将鸭坦布苏病毒
LMH
细胞适应种毒接种至步骤
(1)
的培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附；然后补加病毒维持液继续进行悬浮培养；
[0009](3)
当细胞活率降至
60
％以下时，收获病毒悬液，即得鸭坦布苏病毒抗原液
。
[0010]进一步地，步骤
(2)
中所述鸭坦布苏病毒
LMH
细胞适应种毒的制备方法包括：
[0011]将鸭坦布苏病毒接种至步骤
(1)
的培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附1～
2h
；然后补加病毒维持液继续进行悬浮培养，每隔
12h
取样测定病毒的
TCID
50
，在病毒滴度最高时收获病毒作为下一代驯化的种毒；按此方法连续传代培养3～4代，即为鸭坦布苏病毒
LMH
细胞适应种毒
(
即
DTMUV
‑
S
种毒
)。
进一步地，步骤
(1)
中所述无血清培养基为
LMH SFM 1382
无血清培养基
(
购自上海奥浦迈生物科技股份有限公司
)。
进一步地，悬浮培养的温度为
37
～
38℃
，培养转速为
80rpm
，
pH
为
7.2
±
0.1
，溶氧
DO
为
50
％
。
[0012]进一步地，步骤
(2)
中所述鸭坦布苏病毒
LMH
细胞适应种毒的接种量为
0.02
～
0.05MOI。
[0013]进一步地，步骤
(2)
中所述病毒吸附的时间为
1h
～
2h
，培养温度为
37.5
±
0.5℃
，转速
80rpm
，
pH
为
7.2
±
0.1。
[0014]进一步地，步骤
(2)
中所述补加相同培养体积的病毒维持液，培养温度为
375
±
0.5℃
，培养转速为
80rpm
，
pH
为
7.2
±
0.1。
[0015]进一步地，步骤
(2)
中所述病毒维持液为含
1.2
％葡萄糖的
LMH SFM 1382
无血清培养基
。
[0016]进一步地，步骤
(3)
中当细胞活性降至
60
％以下时，无菌收获病毒悬液
。
[0017]第二方面，本专利技术提供按照所述方法制备得到的抗原液在制备鸭坦布苏病毒疫苗中的应用
。
[0018]本方法生产工艺稳定
、
易操作，病毒含量高，可显著提高疫苗生产效率，适于鸭坦布苏病毒灭活疫苗的生产
。
接种前，通过对鸭坦布苏病毒进行适应与驯化，对悬浮培养
LMH
细胞易感性高，病毒在
LHM
细胞内复制效率高，病毒增殖速度快，培养的病毒液病毒含量高
。
具体实施方式
[0019]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围
。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品
。
[0020]本专利技术中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指
100mL
溶液中含有溶质的克数
。
[0021]以下实施例中使用的鸭坦布苏病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
取
LMH
细胞经复苏后加入到无血清培养基中进行悬浮培养，当细胞长至
2.0
×
106～
4.0
×
106cells/mL
，活率在
90
％以上时，作为用于接种鸭坦布苏病毒的培养基质；
(2)
将鸭坦布苏病毒
LMH
细胞适应种毒接种至步骤
(1)
的培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附；然后补加病毒维持液继续进行悬浮培养；
(3)
当
LMH
细胞活率降至
60
％以下时，收获病毒悬液，即得鸭坦布苏病毒抗原液
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(2)
中所述鸭坦布苏病毒
LMH
细胞适应种毒的制备方法包括：将鸭坦布苏病毒接种至步骤
(1)
的培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附1～
2h
；然后补加病毒维持液继续进行悬浮培养，每隔
12h
取样测定病毒的
TCID
50
，在病毒滴度最高时收获病毒作为下一代驯化的种毒；按此方法连续传代培养3～4代，即为鸭坦布苏病毒
LMH
细胞适应种毒，即
DTMUV
‑
S
种毒；所述鸭坦布苏病毒为
Duck Tembusu virus QYH
‑
2021
‑
E
株，其保藏编号为
CGMCCNo.24470。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(1)
中所述无血清培养基为
LMH SFM 1382
无血清培养基
。4.

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宗学，孙雪，李跃，王增福，李海鹰，史张艳，倪娇，程海波，赵成全，黄跃强，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：