反式互补缺陷猴痘病毒及其应用制造技术

本申请公开了反式互补缺陷猴痘病毒及其应用

【技术实现步骤摘要】
反式互补缺陷猴痘病毒及其应用


[0001]本申请涉及病毒
，尤其是涉及反式互补缺陷猴痘病毒及其应用
。

技术介绍

[0002]猴痘病毒是天花病毒的近亲，其基因组为双链
DNA
，长度接近
200kb
；病毒具有包膜，直径大约
200
‑
300nm
，形似砖型，具有哑铃型内核
。
猴痘病毒在自然界的天然宿主是啮齿类等哺乳动物，主要通过密切接触传播
。
感染猴痘病毒后，皮肤表面会出现大范围的皮疹，伴随有发烧，肌肉酸痛等症状
。
猴痘病毒目前没有专用疫苗和治疗性抗体，天花疫苗对猴痘有一定的预防和保护效果，但对于特定人群的副作用较大
。
国内尚无商用抗猴痘药物和疫苗
。
[0003]猴痘病毒和正痘病毒属的天花病毒和痘苗病毒有较高的同源性，但也编码很多自身特异性的蛋白
。
目前，领域内对猴痘病毒感染后与宿主相互关系的研究尚不充分
。
在病毒学研究中，野生型活病毒是遗传进化和致病机理研究
、
药物筛选和药效评估的“金标准”。
猴痘病毒具有较高的传播能力和致病性，其活毒研究必须在生物安全3级及以上设施内开展，需要熟练的技术操作人员和复杂的安全防护设备
。
对猴痘野生活毒的直接研究存在着额外的病毒泄露风险，亟需高效
、
安全的研究平台去阐明猴痘病毒在宿主上的致病机理
。
[0004]目前应用较多的高安全性病毒系统包括，病毒的亚复制子
(Replicon)、
假病毒系统
、
病毒样颗粒
(VLP)。
病毒亚复制子只能研究病毒在细胞内的复制和扩增
。
假病毒系统在变种病毒的抗体
/
抗血清中和研究中发挥重要作用，但猴痘病毒的双层膜结构具有
50
种以上的表面蛋白，假病毒系统无法模拟猴痘病毒表面的结构
。
病毒样颗粒
(VLP)
虽然可以产生与真实病毒表面类似的机构，但无法用来研究病毒感染后在细胞中和宿主的相互作用
。
[0005]反式互补缺陷病毒系统是在低生物安全条件下开展高致病性病毒基础研究和药物筛选评估的优质病毒平台
。
该系统中的缺陷病毒缺少多个病毒复制和增殖的必需基因区域，只能在特定的回补这些必需基因的细胞系中才能产生子代的缺陷病毒
。
但和
VLP
系统不同的是，反式互补缺陷病毒尽可能维持了病毒其它基因组的完整性，其病毒颗粒具有和野生活毒几乎相同的理化性质；在缺陷病毒感染回补细胞后，可以表达病毒所有的非结构蛋白，便于研究它们和宿主中与各个信号通路的相关性；也可以在药物筛选中模拟最接近于真实病毒感染的全过程
。
反式互补系统往往会缺失多个病毒不同位置和生理阶段的必须基因，来降低病毒通过同源重组发生野生型回复的风险；同时引入重组致死元件来进一步增加病毒的安全性；多种反式互补缺陷病毒的安全性已经在细胞和动物模型上被充分验证
。
[0006]因此，有必要搭建猴痘病毒的反式互补缺陷病毒系统，用于猴痘病毒的遗传进化
、
与宿主相互关系的基础研究和抗猴痘药物的筛选和评估
。

技术实现思路

[0007]本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一
。
为此，本申请提出一种反式互补缺陷猴痘病毒系统，能够于猴痘病毒的遗传进化
、
与宿主相互关系的基础研究和抗
猴痘药物的筛选和评估
。
[0008]本申请的第一方面，提供一种生物材料，该生物材料选自以下
A1)
～
A9)
中的任一种：
A1)
分离的核酸分子，包括猴痘病毒全基因组的核酸序列，所述核酸序列缺失多个基因；
A2)
包含
A1)
所述核酸分子的表达盒；
A3)
包含
A1)
所述核酸分子的载体；
A4)
包含
A2)
所述表达盒的载体；
A5)
包含
A1)
所述核酸分子的细胞；
A6)
包含
A2)
所述表达盒的细胞；
A7)
包含
A3)
所述载体的细胞；
A8)
包含
A4)
所述载体的细胞；
A9)
由
A5)
～
A8)
任一项所述细胞培养产生的缺陷猴痘病毒
。
[0009]在其中一些实施方式中，所述生物材料的所述猴痘病毒全基因组的核酸序列的
GenBank
登录号为
ON563414.3。
[0010]在其中一些实施方式中，所述多个基因中任选相邻两个在所述全基因组的核酸序列上至少距离
1000nt、2000nt、5000nt、10000nt、12000nt、15000nt、20000nt、25000nt、30000nt
以上
。
[0011]在其中一些实施方式中，所述多个基因包括痘病毒感染和复制的必需基因
。
在其中一些实施方式中，所述多个基因包括痘病毒为痘病毒的高度保守基因
。
在其中一些实施方式中，所述多个基因包括病毒细胞进入和蛋白表达的必需基因
。
[0012]在其中一些实施方式中，所述多个基因包括中期转录因子和后期转录因子中的至少一种
。
在其中一些实施方式中，所述核酸序列缺失的多个基因包括
G9R、A9R、A24R、A1L
中的至少两个
、
至少三个
、
全部四个
。
在其中一些实施方式中，所述核酸序列缺失的多个基因包括
A9R、A24R
和
A1L
中的至少一种以及
G9R。
在其中一些实施方式中，所述核酸序列缺失的多个基因包括
G9R
和
A9R
，
G9R
和
A24R
，
G9R
和
A1L
，
G9R、A9R
和
A24R
，
G9R、A9R
和
A1L
，
G9R、A24R
和
A1L
，
G9R、A9R、A24R
和
A1L。
[0013]其中，
G9R(VLTF
‑
1)
作为后期基因转录因子基因，与痘苗病毒哥本哈根株的
G8R
基因相似；
A9R
是中期转录本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
生物材料，其特征在于，选自以下
A1)
～
A9)
中的任一种：
A1)
分离的核酸分子，包括猴痘病毒全基因组的核酸序列，所述核酸序列缺失多个基因；
A2)
包含
A1)
所述核酸分子的表达盒；
A3)
包含
A1)
所述核酸分子的载体；
A4)
包含
A2)
所述表达盒的载体；
A5)
包含
A1)
所述核酸分子的细胞；
A6)
包含
A2)
所述表达盒的细胞；
A7)
包含
A3)
所述载体的细胞；
A8)
包含
A4)
所述载体的细胞；
A9)
由
A5)
～
A8)
任一项所述细胞培养产生的缺陷猴痘病毒
。2.
根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述猴痘病毒全基因组的核酸序列的
GenBank
登录号为
ON563414.3
，和
/
或，所述多个基因包括
G9R、A9R、A24R、A1L
中的至少两个
。3.
反式互补缺陷猴痘病毒系统，其特征在于，包括：权利要求1所述的生物材料；回补细胞，所述回补细胞表达所述生物材料中缺失的多个基因
。4.
复制缺陷型猴痘病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将缺陷猴痘病毒感染回补细胞，拯救得到复制缺陷型猴痘病毒；所述缺陷猴痘病毒缺失多个基因，所述回补细胞表达所述多个基因
。5.
根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缺陷猴痘病毒通过包含以下步骤的方法制得：将猴痘病毒的全长基因中敲除所述多个基因，并插入报告基因，得到缺陷猴痘病毒全长基因；将所述缺陷猴痘病毒全长基因拆分，设计引物分别扩增，并通过同源重组的方法分别克隆到重组载体中；酶切所述重组载体后，用连接酶连接，得到猴痘病毒全基因组敲除所述多...

【专利技术属性】
技术研发人员：程功，刘洋，刘建英，朱龙超，梅玲玲，刘媛媛，袁育林，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：