一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法技术

本发明专利技术公开一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法，属于细胞诱导剂和细胞诱导方法技术领域。所述的诱导剂包括红桂木凝集素；所述的诱导剂还包括细胞因子IL‑2；所述的干细胞样记忆性T细胞为CD3+细胞的亚群。本研究发现了ALL联合细胞因子IL‑2可以在体外诱导TSCM细胞产生并促使增殖和集落形成，快速诱导CD3+T细胞扩增为TSCM，有效提高CD3+TSCM的绝对数和形成比例，其诱导效果优于单独使用红桂木凝集素或细胞因子IL‑2进行扩增的效果。

An in vitro inducer and induction method for stem cell like memory T cells

The invention discloses an in vitro inducer and an induction method for a stem cell like memory T cell, which belongs to the technical field of cell inducer and cell induction method. Inducer comprising Artocarpus lingnanensis lectin; inducing agent includes the cytokine IL 2; the stem cell like memory T cells for CD3+ cell subsets. The study found that the ALL IL 2 combined with cytokines can be induced in vitro TSCM cells and promote the proliferation and colony formation of CD3+T cells induced by rapid amplification of TSCM, effectively improve the absolute number of CD3+TSCM formation and proportion, the induction effect is better than single use of Artocarpus lingnanensis lectin or cytokine IL 2 amplification effect.

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法
本专利技术属于一种细胞培养诱导剂及细胞的诱导方法，具体涉及一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法。
技术介绍
2005年，Zhang等在研究小鼠移植物抗宿主反应疾病(graftversushostdisease，GVHD)模型中发现，一群来源于供体的CD8+T细胞在GVHD发生的过程中持续存在，造成宿主损伤。与初始T细胞或成熟记忆性T细胞相比，这群T细胞具有干细胞的特征，即能够自我更新，在体内能够分化产生中枢性和效应性记忆性CD8+T细胞，并且产生的这些子代细胞表现出记忆性T细胞的特征，能够快速对再次免疫的抗原产生反应并且分化为效应细胞，引起GVHD。研究人员将这群细胞定义为“干细胞样记忆性T细胞”，或称为“TSCM细胞”。TSCM细胞具备快速增殖能力，在归巢因子IL-15和IL-7作用下，能够快速的增殖，CD8+TSCM细胞在IL-15作用下能快速的分裂，这种分裂方式与干细胞非常类似，增殖的两个子代细胞中，一个子代细胞继续分化为其他细胞类型，另外一个自我复制，依然维持母代细胞的表型，因此虽然经历多代细胞分裂，部分细胞仍然处于静息状态，依然具有产生子代细胞的增值和分化能力。在IL-7的刺激下，CD4+TSCM细胞具有相似的能力。TSCM细胞一方面可分泌具有杀伤能力的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、granzymeB等；另一方面，在遇到抗原刺激时还可迅速分化成为效应T细胞，中央记忆性T细胞以及效应记忆性T细胞，发挥其快速免疫应答的功能。TSCM细胞具有很强的抗肿瘤功能，无论在动物模型和人源化小鼠黑色素瘤模型中均观察到这种现象。研究人员推测TSCM细胞的抗肿瘤效应，除了可能由于其具有很强的增殖能力和分化能力，同时也与自身能够产生抗肿瘤的细胞因子如IFN-γ有关。另外，TSCM白血病的治疗中也表现出较强的免疫抗肿瘤能力。这群细胞作为一种具有自我更新能力和多能性潜力的T细胞亚群，在诸多的免疫性疾病中都发挥着重要的作用。上述研究结果提示TSCM细胞具备干细胞的特性，具有很强的增殖和分化能力，体外移植实验表明其具有很强的生存能力，TSCM细胞能有效的扩增，并保持长效的记忆T细胞能力，TSCM细胞所具备的这些特征解决了临床上移植细胞体外扩增难的问题。其次，TSCM细胞很强的生存能力使得植入体内细胞生存时间延长，并且自身能够产生具有抗肿瘤功能的细胞因子。因此人们还可以进一步探索如何利用体外扩增TSCM细胞来作为新的过继免疫治疗策略。TSCM细胞有可能成为最为有效的ACT(theadoptivecelltransfer，ACT)治疗肿瘤的细胞类型。由于TSCM细胞在人体中的比例非常低，由此，探索如何能够诱导这种细胞快速扩增的方法就变得尤为重要和迫切。红桂木凝集素(artocarpuslingnanensislectin，ALL)是一种性质稳定、凝集活性高的植物凝集素，有研究发现，ALL能诱导T细胞的活化，能促进人外周血单核细胞来源的树突状细胞的成熟及增殖。基于ALL在激活T细胞、树突状细胞增殖生长方面的重要作用，联合细胞因子IL-2，本研究试图探索ALL在体外是否可诱导人TSCM细胞的扩增，并检测其在TSCM细胞诱导生成中的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种红桂木凝集素联合细胞因子IL-2在体外诱导人外周血CD3+T细胞产生人TSCM细胞的扩增。本专利技术的另一目的是提供一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导扩增的方法。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂，所述的诱导剂包括红桂木凝集素；所述的诱导剂还包括细胞因子IL-2；所述的干细胞样记忆性T细胞为CD3+细胞的亚群。优选的，所述的CD3+细胞的亚群是指在CD3+细胞中选定CD45RA+CD45RO－的细胞亚群，进一步再选出CD62L+CCR7+的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定CD95+CD122+双阳性细胞。一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，具体步骤为：（1）将分选获得的CD3+细胞置于添加有流式细胞术用抗体的细胞培养液中培养；（2）在培养液中加入诱导剂红桂木凝集素和细胞因子IL-2进行诱导培养；（3）诱导培养完成后，分选出CD3+TSCM细胞。优选的，所述的红桂木凝集素的浓度为2.5~10ug/ml，所述的细胞因子IL-2的浓度为5~25ng/ml。优选的，所述的红桂木凝集素的浓度为7.5ug/ml，所述的细胞因子IL-2的浓度为12.5ng/ml。优选的，所述的TSCM细胞培养时间在6~8天左右。优选的，所述的流式细胞术用抗体包括humanCD3-APC、FITC、humanCD8-APC、humanCD8-Pacificblue、humanCD45RA-PE、humanCD45RO-PE-Cy5、humanCD62L-PE-Cy7、humanCCR7-FITC、humanCD95-PE-Cy5和humanCD122-PE的一种或多种。一种红桂木凝集素在制备干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂的应用。一种红桂木凝集素和细胞因子IL-2在制备干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂的应用。本专利技术突出的实质性进步和显著的特点是：本研究发现了ALL联合细胞因子IL-2可以在体外诱导TSCM细胞产生并促使增殖和集落形成，快速诱导CD3+T细胞扩增为TSCM，有效提高CD3+TSCM的绝对数和形成比例，其诱导效果优于单独使用红桂木凝集素或细胞因子IL-2进行扩增的效果。ALL联合细胞因子IL-2可以在体外诱导TSCM细胞产生，具有一定的浓度梯度依赖性，其中最佳的浓度组合是7.5ug/mlALL+12.5ng/mlIL-2。随着处理时间的延长，能够诱导产生更多的TSCM细胞。但是，如果处理时间过长，细胞会出现一定程度的死亡。因此，诱导TSCM的最佳时间为6~8天。本专利技术提供的ALL、细胞因子IL-2具有安全性高，不存在药物毒性，能为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。附图说明图1是构建的流式检测TSCM细胞的模板。图2是ALL+IL-2处理组对TSCM细胞扩增结果。图3是ALL处理组对TSCM细胞扩增结果。图4是IL-2处理组对TSCM细胞扩增结果。图5是不同浓度ALL，IL-2，以及ALL+IL-2组合对TSCM细胞增殖率的影响；其中A1~A4分别为：2.5ug/ml、5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml的ALL；B1~B4分别为：5ng/ml、7.5ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml的IL-2；C1~C16分别为：2.5ug/mlALL+5ng/mlIL-2、2.5ug/mlALL+7.5ng/mlIL-2、2.5ug/mlALL+12.5ng/mlIL-2、2.5ug/mlALL+25ng/mlIL-2、5ug/mlALL+5ng/mlIL-2、5ug/mlALL+7.5ng/mlIL-2、5ug/mlALL+12.5ng/mlIL-2、5ug/mlALL+25ng/mlIL-2、7.5ug/mlALL+5ng/mlIL-2、7.5ug/mlALL+7.5ng/mlIL-2、7.5ug/mlALL+12.5ng/mlIL-2、7.5ug/mlA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂，其特征在于，所述的诱导剂包括红桂木凝集素；所述的诱导剂还包括细胞因子IL‑2；所述的干细胞样记忆性T细胞为CD3+细胞的亚群。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂，其特征在于，所述的诱导剂包括红桂木凝集素；所述的诱导剂还包括细胞因子IL-2；所述的干细胞样记忆性T细胞为CD3+细胞的亚群。2.根据权利要求1所述的干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂，其特征在于，所述的CD3+细胞的亚群是指在CD3+细胞中选定CD45RA+CD45RO－的细胞亚群，进一步再选出CD62L+CCR7+的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定CD95+CD122+双阳性细胞。3.一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，其特征在于，具体步骤为：（1）将分选获得的CD3+细胞置于添加有流式细胞术用抗体的细胞培养液中培养；（2）在培养液中加入诱导剂红桂木凝集素和细胞因子IL-2进行诱导培养；（3）诱导培养完成后，分选出CD3+TSCM细胞。4.根据权利要求3所述的干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，其特征在于，所述的红桂木凝集素的浓度为2.5~10ug/ml，所述的细胞因子IL-2的浓度为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：周素芳，曾麒燕，宾晓芸，陈安宁，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45