头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体的方法及其应用。所述头孢菌素羟化酶突变体的氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO:2为参考序列，具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸中的至少一者的突变，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。本发明专利技术的头孢菌素羟化酶突变体具有提高的催化活性和耐热性，更适于商业和工业应用。

Cephalosporin hydroxylase mutant, DNA encoding the mutant, method of using the mutant and its application

The present invention provides a cephalosporin hydroxylase mutant, a DNA encoding the mutant, a method for using the mutant and its application. The amino acid sequence of the cephalosporin hydroxylase mutants in sequences of the list of SEQ ID NO:2 as reference sequence, with the mutation at position twenty-ninth, fortieth, forty-first glycine, alanine, glycine at 182nd arginine and threonine 272nd in at least one, and compared with the wild type cephalosporin hydroxylase activity the cephalosporin hydroxylase mutants at least 10% higher, high heat resistance of at least 150%. The cephalosporin hydroxylase mutant of the present invention has improved catalytic activity and heat resistance, and is more suitable for commercial and industrial applications.

【技术实现步骤摘要】
头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体的方法及其应用
本专利技术属于基因工程和蛋白质工程领域，具体而言，涉及头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体的方法及其应用。
技术介绍
脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)(式1)是头孢类抗生素的前体之一。目前其由7-氨基头孢烷酸(7-ACA)(式2)制备。脱乙酰-7-氨基头孢烷酸也可经苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)(式3)从7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)(式4)用酶法合成；所涉的酶分别是青霉素酰化酶和头孢菌素羟化酶。目前，上述头孢菌素羟化酶对商业上比较容易取得的底物苯乙酰-7-ADCA的活力低(参见WO2008/107782；445/CHE/2009,Coque,J.J.R.,等；Appl.Microbiol.Biotechnol.44,605-609,1996；EP465189；US6,180,361)。因此，科学家们正在努力改善其活力(WO2013/105030)。目前仍需提高头孢菌素羟化酶的耐热性和其对G-7-ADCA的催化活性。
技术实现思路
为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体的方法及其应用。具体而言，本专利技术提供了：(1)一种头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQIDNO.:2为参考序列，具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸中的至少一者的突变，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。(2)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸。(3)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸。(4)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。(5)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸。(6)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。(7)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸和第41位甘氨酸的突变。(8)根据(7)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，并且所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。(9)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸、第41位甘氨酸和第272位苏氨酸的突变。(10)根据(9)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。(11)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸和第272位苏氨酸的突变。(12)根据(11)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸、所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸、所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。(13)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸的突变。(14)根据(13)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸、所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸、所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸、所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。(15)一种DNA，其含有编码(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体的核苷酸序列。(16)(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌(G-7-ADCA)素为底物。(17)(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。(18)(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。(19)一种用于制备苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)的方法，包括使(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。(20)一种用于制备脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的方法，包括使(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。(21)一种用于制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的方法，包括使(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和积极效果：本专利技术通过对棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)的头孢菌素羟化酶进行基因工程改造，提高了该酶对G-7-ADCA的催化活性和耐热性。与野生型头孢菌素羟化酶相比，本专利技术的头孢菌素羟化酶突变体的酶活性可提高至少10％，耐热性可提高至少150％。本专利技术的头孢菌素羟化酶突变体更适于商业和工业应用。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本专利技术作进一步说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。为了解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术的专利技术人进行了大量深入的理论研究和实验摸索，利用遗传工程和蛋白质工程技术，对棒状链霉菌的头孢菌素羟化酶进行了突变改造，最终获得了一系列具有高酶活和高耐热性的头孢菌素羟化酶突变体，可更有利地用于生产G-D-7-ACA。具体而言，本专利技术提供了一种头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQIDNO.:2为参考序列，具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸中的至少一者的突变，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。优选地，所述第29位甘氨酸突变为组氨酸。优选地，所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸。优选地，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。优选地，所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸。优选地，所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。优选地，所述头孢菌素羟化酶突变体同时具有位于第29位甘氨酸的突变和位于第41位甘氨酸的突变。还优选地，所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，并且所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。优选地，所述头孢菌素羟化酶突变体同时具有位于第29位甘氨酸的突变、位于第41位甘氨酸的突变、和位于第272位苏氨酸的突变。还优选地，所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，所述第41位甘氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸中的至少一者的突变，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。

【技术特征摘要】
1.一种头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQIDNO.:2为参考序列，具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸中的至少一者的突变，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。2.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸。3.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸。4.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。5.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸。6.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。7.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸和第41位甘氨酸的突变。8.根据权利要求7所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，并且所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。9.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸、第41位甘氨酸和第272位苏氨酸的突变。10.根据权利要求9所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。11.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸和第272位苏氨酸的突变。12.根据权利要求11所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸、所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸、所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕旭新，郑绍明，邹宛颖，萧游龙，王骏，
申请(专利权)人：百瑞全球有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB