一种15α‑羟化酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种15α‑羟化酶及其制备方法和应用。所述突变体是借助易错PCR和定点突变的方法对目标基因进行突变，筛选获得的，突变体Kcat值为原始15α‑羟化酶的2.5倍，该突变体在30m

A 15 alpha hydroxylase and its preparation method and Application

The invention belongs to the technical field of genetic engineering of enzymes, in particular to a 15 alpha hydroxylase and its preparation method and application. The mutant is the target gene mutation by means of error prone PCR and point mutation, screening, mutant Kcat value was 2.5 times of the original 15 alpha hydroxylase, the mutant in 30m

【技术实现步骤摘要】
一种15α-羟化酶及其制备方法和应用
：本专利技术属于酶的基因工程
，具体涉及一种15α-羟化酶及其制备方法和甾体转化新技术。
技术介绍
：甾体激素类药物是临床上一类重要的药物，常用于治疗类风湿性关节炎、哮喘、心血管、抗肿瘤等疾病。甾体类药物孕二烯酮是新一代强效避孕药的主要成分之一，而15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成孕二烯酮的关键中间体。工业上，甾体转化有两种实施方式：化学法和微生物转化法。微生物甾体转化法是经微生物细胞的酶系对底物某一特定部位进行生化反应形成的，其与化学方法相比具有以下优点：(1)合成步骤少，生产周期短。如，用微生物法一步可将19-羟基-雄甾-4-烯-3，17-二酮转化成雌酚酮，而化学法至少需三步才能完成。(2)收率高，副反应少。多数情况下，微生物法得率达80％以上，而化学合成法收率仅为15％-20％。微生物法生产炔诺酮的得率可由化学法的3％-4％提高到40％-70％。(3)较复杂和难以进行的化学反应采用微生物转化法往往可专一、迅速地完成。(4)反应具有区域选择性和立体选择性。如羟化反应可专一的在C11、C15等位置上进行羟化，α位或β位上的羟化也可以选择合适的微生物进行。(5)可避免或减少强酸、强碱和一些有毒原料的使用，改善操作条件，对环境友善。目前工业上主要采用丝状真菌雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)在左旋乙基甾烯双酮的C15位上特异引入羟基，但现有的工业生产工艺投料量偏低，从而限制了C15α的转化效率。已有的研究表明参与雷斯青霉C15α甾体羟化反应的酶属于P450酶系，但编码该15α-羟化酶的基因尚不清楚，因此无法利用基因工程手段对生产菌种进行定向遗传改造。
技术实现思路
：本专利技术解决上述问题所采用的技术方案之一，是提供一种通过基因工程手段获得的酶活性显著提高的15α-羟化酶突变体。所述突变体是在受甾体底物高度诱导的目标基因的基础上借助易错PCR和定点突变的方法对目标基因进行突变，筛选获得的最优突变体，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.5所示。在本专利技术中采用如下定义：1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2、15α-羟化酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示15α-羟化酶突变体中突变的氨基酸。如Ala376Glu，表示位置376位的氨基酸由原始15α-羟化酶的Ala替换成Glu，位置的编号对应于SEQIDNo.3中15α-羟化酶的氨基酸序列编号。如Ala376Glu/Phe382Gln，表示位置376和位置382的氨基酸都发生了突变。在本专利技术中，ahdA表示原始15α-羟化酶(核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.3所示)，ahdA’表示15α-羟化酶的突变体(核苷酸序列如SEQIDNo.4所示,氨基酸序列如SEQIDNo.5所示)。15α-羟化酶/突变体氨基酸ahdAAla376Phe382ahdA’Glu376Gln382用于表达所述的15α-羟化酶及其突变体的克隆载体和表达载体为pET22b；用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为大肠杆菌BL21。本技术方案的实验步骤概述如下：(1)采用PCR技术以雷斯青霉ATCC10490(ATCC10490菌株已公开在非专利文献《15a-Hydroxylationofasteroid(13-ethyl-gon-4-en-3,17-dione)byPenicilliumraistrickiiinanionicliquid/aqueousbiphasicsystem》BiotechnolLett(2012)34:2113-2117中)总RNA为模板，逆转录合成第一链cDNA，并以第一链cDNA为模板设计引物，扩增获取15α-羟化酶基因，插入pET22b克隆载体上构建重组质粒，转入E.coliJM109，测序鉴定15α-羟化酶基因adhA；(2)以上述构建正确的重组质粒为基础优化15α-羟化酶编码基因adhA,并通过全基因合成技术获得密码子优化的15α-羟化酶编码基因adhA-1(SEQIDNo.2)；(3)在体外利用易错PCR技术向15α-羟化酶基因adhA-1引入核苷酸突变；(4)将易错PCR产物及pET22b表达载体用EcoRI和NotI双酶切后连接，连接产物转入E.coliJM109构建易错PCR突变体库，采用抗生素筛选突变质粒；(5)将突变质粒CaCl2化学转化法转入E.coliBL21感受态细胞，构成突变文库；(6)采用96孔板和TLC板筛选15α-羟化酶活性较高的菌株；(7)通过定点突变的方法，对上述酶活较高菌株的突变位点进行组合，将含有上述突变位点组合的基因与载体pET22b连接，CaCl2化学转化法转入E.coliBL21，以获得15α-羟化酶高效诱导表达的菌株及15α-羟化酶adhA’。本专利技术解决上述问题所采用的技术方案之二，是提供一种技术方案一所述15α-羟化酶突变体的生产方法，具体如下：以技术方案一所得菌株为生产菌株；种子培养：二级种子培养OD600测定为6时，用于发酵罐接种；发酵罐准备：以M9培养基为发酵培养基，接种量2％～10％,pH6.5～7.5；所述M9培养基组成为：15.113g/LNa2HPO4·12H2O,3g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，MgSO41mM，甘油50g/L，微量元素0.1％；所述微量元素组成为(g/L)：FeCl3·6H2O2.4，CoCl2·6H2O0.3，CuCl2·2H2O0.15，ZnCl20.3，Na2MoO4·H2O0.3，H3BO30.07，MnCl2·4H2O0.49。菌体生长阶段：发酵温度为35～42℃，DO维持20％以上，当发酵培养基中甘油耗尽后，DO快速上升，随即进入补料生长及诱导产酶阶段；补料生长及诱导产酶阶段：流加50％甘油(含5％的IPTG或乳糖)，初始流加速度为5.0mL/min，当DO低于20％时停止流加，待甘油再次耗尽，DO快速上升后诱导产酶阶段结束，收集细胞用于甾体转化；甾体转化阶段：流加底物至终浓度0.5％，底物转化60～72h直至底物完全转化完成。有益效果：1、本专利技术中采用密码子优化、易错PCR及定点突变技术在体外对15α-羟化酶编码基因adhA进行定向进化，筛选出15α-羟化酶活性显著提高的突变体，突变体Kcat值为原始15α-羟化酶的2.5倍。2、本专利技术所述酶的制备过程易于实施且产酶效率高，30m3体系下发酵液酶活达3000U/mL。3、本专利技术所述的甾体高效转化过程，30m3体系下转化率高于95％，转化速率为工业生产现有水平的两倍。具体实施方式：实施例中涉及到的培养基配方如下：(1)LB液体培养基(w/v)：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0。(2)M9培养基：15.113g/LNa2HPO4·12H2O,3g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，MgSO41mM，甘油50g/L，微量元素0.1％；微量元素(g/L)：FeCl3·6H2O2.4，CoCl2·6H2O0.3，CuCl2·2H2O0.15，ZnCl20.3，Na2Mo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种15α‑羟化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种15α-羟化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示。2.权利要求1所述的一种15α-羟化酶突变体的编码基因。3.权利要求2所述一种15α-羟化酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQIDNo.4所示。4.权利要求1所述一种15α-羟化酶突变体或权利要求2所述基因的用途。5.一种包含权利要求3所述的基因的表达载体和/或宿主细胞。6.如权利要求5所述的表达载体和/或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为pET22b，宿主细胞为大肠杆菌BL21。7.权利要求1所述15α-羟化酶突变体的生产方法，其特征在于，具体如下：以包含有权利要求2所述15α-羟化酶突变体编码基因的菌株为生产菌株；种子培养：二级种子培养，OD600测定为6时，用于发酵罐接种；发酵罐准备：以M9培养基为发酵培养基2接种量2％～10％,pH6.5～7.5；菌体生长阶段：发酵温度为35～42℃，DO维持20％以上...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓光，路福平，王正祥，田康明，郭凯，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12