用于生物合成罗汉果苷化合物的方法和材料技术

本发明专利技术提供了用于重组和酶促产生罗汉果苷化合物和含有罗汉果苷化合物之组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物合成罗汉果苷化合物的方法和材料专利技术背景
本专利技术涉及用于生物合成罗汉果醇前体、罗汉果醇和/或罗汉果苷的方法和材料。更具体地说，本专利技术涉及使用葫芦二烯醇合酶、细胞色素P450、细胞色素P450还原酶和/或环氧化物水解酶以产生罗汉果醇前体和/或罗汉果醇的方法。本专利技术还涉及使用尿苷-5′-二磷酸(uridine-5’-diphospho，UDP)依赖性葡糖基转移酶(UGT)来糖基化罗汉果醇并产生多种罗汉果苷的方法。
技术介绍
罗汉果苷是分离自罗汉果(Siraitiagrosvenorii(S.grosvenorii，Swingle))果实的三萜糖苷家族，罗汉果也被称为Momordicagrosvenori。果实提取物在商业上被用作天然甜味剂。已经从罗汉果中鉴定了有助于果实甜度的四种主要化合物，即罗汉果苷V、罗汉果苷IV、赛门苷I和11-氧代罗汉果苷V(参见图1).罗汉果苷V是这四种化合物中最丰富的，约为干果实的0.57％(w/w)，其次是罗汉果苷IV和赛门苷I，其各自含有四个葡萄糖部分.11-氧代罗汉果苷V在C11处具有酮基而非羟基.参见例如Takemoto等，1983，YakugakuZasshi103：1151-4；1155-66；1167-73；Kasai等，1989，Agric.Biol.Chem.53：3347-9；MatsumotoChem.Pharm.Bull.，1990，38：2030-2；和Prakash等，2011，J.CarbohydrateChem.30：16-26。所有的罗汉果苷共有相同的罗汉果醇三萜核心。糖苷配基(aglycone)罗汉果醇被不同数目的葡萄糖部分糖基化以形成多种罗汉果苷化合物。可以以下列方式合成罗汉果苷：从常见的三萜前体氧化角鲨烯合成葫芦二烯醇，将葫芦二烯醇氧化以产生罗汉果醇，并且将罗汉果醇糖基化以产生多种罗汉果苷。参见Tang等，BMCGenomics12：343(2011)。Tang等，2011，BMCGenomics12：343描述了作为参与罗汉果苷生物合成之潜在候选物的七种细胞色素P450和五种UGT。然而，Tang等没有具体鉴定参与罗汉果苷生物合成的任何细胞色素P450或UGT。因此，仍然需要鉴定能够作用于任何罗汉果代谢物的细胞色素P450和UGT。另外，虽然可以从罗汉果中提取罗汉果苷，但是仍然需要在用于商业用途的重组宿主中改进罗汉果苷的产生。专利技术概述在上述背景下，本专利技术提供了相对于现有技术的某些优点和进步。本专利技术提供了用于生物合成罗汉果苷化合物的方法和材料，并提供了参与罗汉果苷生物合成的酶。尽管本文公开的本专利技术不限于具体的优点或功能，但是本专利技术提供了重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码角鲨烯环氧酶多肽的基因；(b)编码葫芦二烯醇合酶多肽的基因；(c)编码细胞色素P450多肽的基因；(d)编码细胞色素P450还原酶多肽的基因；(e)编码环氧化物水解酶多肽的基因；(f)编码与SEQIDNO：48所示的氨基酸序列具有60％或更高同一性的UGT1576多肽的基因；(g)编码与SEQIDNO：62所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的UGT430多肽的基因；(h)编码与SEQIDNO：68所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的UGT1697多肽的基因；(i)编码与SEQIDNO：72所示的氨基酸序列具有50％或更高同一性的UGT11789多肽的基因；(j)编码与SEQIDNO：53所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的UGT98多肽的基因；(k)编码与SEQIDNO：50所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的UGTSK98多肽的基因；其中至少一种所述基因是重组基因；其中所述宿主能够产生罗汉果醇前体、罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物。在本文所公开的重组宿主的一些方面中：(a)所述角鲨烯环氧酶多肽包含与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的多肽；(b)所述葫芦二烯醇合酶多肽包含与SEQIDNO：43所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的多肽；(c)所述细胞色素P450多肽包含与SEQIDNO：44所示的氨基酸序列具有50％或更高同一性的CYP5491多肽，和/或与SEQIDNO：74所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的CYP1798多肽；(d)所述细胞色素P450还原酶多肽包含与SEQIDNO：46所示的氨基酸序列具有50％或更高同一性的CPR4497多肽；和/或(e)所述环氧化物水解酶多肽包含与SEQIDNO：38所示的氨基酸序列具有75％或更高同一性的环氧化物水解酶1多肽，或与SEQIDNO：40所示的氨基酸序列具有65％或更高同一性的环氧化物水解酶2多肽。本专利技术还提供了重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码能够催化环氧角鲨烯(dioxidosqualene)转化以产生24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(b)编码能够催化氧化角鲨烯转化以产生葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(c)编码能够催化24，25环氧葫芦二烯醇羟基化以产生11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(d)编码能够催化葫芦二烯醇羟基化以产生11-羟基-葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(e)编码能够催化葫芦二烯醇环氧化以产生24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；或者(f)编码能够催化11-羟基-葫芦二烯醇环氧化以产生11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(g)编码能够催化11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇转化以产生罗汉果醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；或者(h)编码能够催化罗汉果苷前体糖基化以产生罗汉果苷化合物的一种或更多种酶的一种或更多种基因；其中至少一种所述基因是重组基因。在本文公开的重组宿主的一个方面中，所述重组宿主还包含编码与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的角鲨烯环氧酶多肽的基因。在本文公开的重组宿主的一个方面中，所述重组宿主已被修饰成减少羊毛甾醇合酶(ERG7)多肽的表达.在本文公开的重组宿主的一个方面中，所述ERG7多肽包含具有SEQIDNO：55所示的氨基酸序列的多肽。本专利技术还提供了产生罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物的方法，其包括：(a)在表达本文公开的所述基因的条件下，在培养基中培养本文公开的重组宿主；其中所述罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物由所述重组宿主合成；并且(b)任选地分离所述罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物。在本文公开的方法的一些方面中，所述罗汉果苷前体是通过以下合成的罗汉果醇：将11-羟基-葫芦二烯醇环氧化以合成11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇，并且将11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇水解以合成罗汉果醇。在本文公开的方法的一些方面中，将11-羟基-葫芦二烯醇环氧化以合成11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇是由与SEQIDNO：74所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的CYP1798多肽所催化的。本专利技术还提供了在体外产生罗汉果醇前体的方法，其包括：(a)将环氧角鲨烯与能够催化环氧角鲨烯转化以产生24，25环氧葫芦二本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码角鲨烯环氧酶多肽的基因；(b)编码葫芦二烯醇合酶多肽的基因；(c)编码细胞色素P450多肽的基因；(d)编码细胞色素P450还原酶多肽的基因；(e)编码环氧化物水解酶多肽的基因；(f)编码与SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列具有60％或更高同一性的UGT1576多肽的基因；(g)编码与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的UGT430多肽的基因；(h)编码与SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的UGT1697多肽的基因；(i)编码与SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列具有50％或更高同一性的UGT11789多肽的基因；(j)编码与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的UGT98多肽的基因；(k)编码与SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的UGTSK98多肽的基因；其中至少一种所述基因是重组基因；其中所述宿主能够产生罗汉果醇前体、罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物.

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.01 US 14/504,109;2014.10.02 US 62/059,136;1.重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码角鲨烯环氧酶多肽的基因；(b)编码葫芦二烯醇合酶多肽的基因；(c)编码细胞色素P450多肽的基因；(d)编码细胞色素P450还原酶多肽的基因；(e)编码环氧化物水解酶多肽的基因；(f)编码与SEQIDNO：48所示的氨基酸序列具有60％或更高同一性的UGT1576多肽的基因；(g)编码与SEQIDNO：62所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的UGT430多肽的基因；(h)编码与SEQIDNO：68所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的UGT1697多肽的基因；(i)编码与SEQIDNO：72所示的氨基酸序列具有50％或更高同一性的UGT11789多肽的基因；(j)编码与SEQIDNO：53所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的UGT98多肽的基因；(k)编码与SEQIDNO：50所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的UGTSK98多肽的基因；其中至少一种所述基因是重组基因；其中所述宿主能够产生罗汉果醇前体、罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物.2.权利要求1所述的重组宿主，其中：(a)所述角鲨烯环氧酶多肽包含与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的多肽；(b)所述葫芦二烯醇合酶多肽包含与SEQIDNO：43所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的多肽；(c)所述细胞色素P450多肽包含与SEQIDNO：44所示的氨基酸序列具有50％或更高同一性的CYP5491多肽，和/或与SEQIDNO：74所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的CYP1798多肽；(d)所述细胞色素P450还原酶多肽包含与SEQIDNO：46所示的氨基酸序列具有50％或更高同一性的CPR4497多肽；和/或(e)所述环氧化物水解酶多肽包含与SEQIDNO：38所示的氨基酸序列具有75％或更高同一性的环氧化物水解酶1多肽，或与SEQIDNO：40所示的氨基酸序列具有65％或更高同一性的环氧化物水解酶2多肽。3.重组宿主，其包含以下的一种或更多种：(a)编码能够催化环氧角鲨烯转化以产生24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(b)编码能够催化氧化角鲨烯转化以产生葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(c)编码能够催化24，25环氧葫芦二烯醇羟基化以产生11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(d)编码能够催化葫芦二烯醇羟基化以产生11-羟基-葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(e)编码能够催化葫芦二烯醇环氧化以产生24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；或者(f)编码能够催化11-羟基-葫芦二烯醇环氧化以产生11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；(g)编码能够催化11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇转化以产生罗汉果醇的一种或更多种酶的一种或更多种基因；或者(h)编码能够催化罗汉果苷前体糖基化以产生罗汉果苷化合物的一种或更多种酶的一种或更多种基因；其中至少一种所述基因是重组基因。4.权利要求3所述的重组宿主，其还包含编码与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列具有45％或更高同一性的角鲨烯环氧酶多肽的基因。5.权利要求1至4中任一项所述的重组宿主，其中所述重组宿主已被修饰成减少羊毛甾醇合酶(ERG7)多肽的表达。6.权利要求5所述的重组宿主，其中所述ERG7多肽包含具有SEQIDNO：55所示的氨基酸序列的多肽。7.产生罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物的方法，其包括：(a)在表达权利要求1至6中任一项所公开的基因的条件下，在培养基中培养权利要求1至6中任一项所述的重组宿主；其中所述罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物由所述重组宿主合成；并且(b)任选地分离所述罗汉果苷前体和/或罗汉果苷化合物。8.权利要求7所述的方法，其中所述罗汉果苷前体是通过以下合成的罗汉果醇：将11-羟基-葫芦二烯醇环氧化以合成11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇，并且将11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇水解以合成罗汉果醇。9.权利要求8所述的方法，其中将11-羟基-葫芦二烯醇环氧化以合成11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇是由与SEQIDNO：74所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的CYP1798多肽所催化的。10.在体外产生罗汉果醇前体的方法，其包括：(a)将环氧角鲨烯与能够催化环氧角鲨烯转化以产生24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶接触；或者(b)将氧化角鲨烯与能够催化氧化角鲨烯转化以产生葫芦二烯醇的一种或更多种酶接触；或者(c)将24，25环氧葫芦二烯醇与能够催化24，25环氧葫芦二烯醇羟基化以产生11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶接触；或者(d)将葫芦二烯醇与能够催化葫芦二烯醇羟基化以产生11-羟基-葫芦二烯醇的一种或更多种酶接触；或者(e)将葫芦二烯醇与能够催化葫芦二烯醇环氧化以产生24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶接触；或者(f)将11-羟基-葫芦二烯醇与能够催化11-羟基-葫芦二烯醇环氧化以产生11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶接触。11.在体外产生罗汉果醇的方法，其包括将11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇与能够催化11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇转化以产生罗汉果醇的一种或更多种酶接触。12.在体外产生罗汉果苷化合物的方法，其包括将罗汉果苷前体与能够催化罗汉果苷前体糖基化以产生罗汉果苷化合物的一种或更多种酶接触。13.权利要求10至12中任一项所述的方法，其还包括分离所述罗汉果醇前体、罗汉果醇或所述罗汉果苷化合物。14.权利要求3所述的重组宿主或权利要求10至13中任一项所述的方法，其中：(a)所述能够催化环氧角鲨烯转化以产生24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶包含与SEQIDNO：43所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的葫芦二烯醇合酶；(b)所述能够催化氧化角鲨烯转化以产生葫芦二烯醇的一种或更多种酶包含与SEQIDNO：43所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的葫芦二烯醇合酶；(c)所述能够催化24，25环氧葫芦二烯醇转化以产生11-羟基-24，25环氧葫芦二烯醇的一种或更多种酶包含与SEQIDNO：44所示的氨基酸序列具有50％或更高同一性的CYP5491；(d)所述能够催化葫芦二烯醇转...

【专利技术属性】
技术研发人员：延斯·霍顿拉森，卡塔尔济纳·克日什塔内克，安格利卡·塞姆莱尔，艾弗·克拉夫斯·里谢德·汉森，索伦·达姆基埃尔，加里·刘，刘耀权，约恩·汉森，萨西什·库马尔，穆特斯瓦米·潘沙佩奇萨·穆拉利，尼纳·尼科利纳·拉斯穆森，
申请(专利权)人：埃沃尔瓦公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH