一种从55天果龄罗汉果中提取及检测罗汉果苷IV、苷V的方法，采用60%乙醇水溶液加超声波辅助提取，用Ca（OH）2絮凝、过滤、浓缩回收乙醇；采用D101大孔树脂进行分离、纯化：pH为9.0，使用两倍柱体积每小时的流速过柱，依次用纯水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脱；收集60%乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥。用HPLC检测，色谱柱条件为C18柱，乙腈‑水溶液为21:79；检测波长203nm；流速1 mL/min，柱温25℃，进样量10µL，跑柱30min。检测时，罗汉果苷IV、罗汉果苷V的吸收峰明显，罗汉果苷IV含量大于5.0%，罗汉果苷V含量大于15.0%，实现罗汉果苷IV、罗汉果苷V同步提取和检测，具有产业化意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物提取领域，尤其是一种从罗汉果中提取及检测罗汉果苷的方法。
技术介绍
罗汉果里的葫芦烷型三萜苷类成分是甜味物质的主要部分，主要为罗汉果苷Ⅳ(mogrosideⅣ)、罗汉果苷Ⅴ(mogrosideⅤ)，罗汉果苷IV、罗汉果苷V分子结构上相差一个葡萄糖基，理学性质接近，很难分离。公布号为CN104069152A的专利技术专利，公开了一种罗汉果苷Ⅳ含量高的提取物制备方法，罗汉果→磨碎→提取→过滤→滤液→膜分离→吸附分离→洗脱1→乙醇回收1→树脂脱色→干燥→罗汉果甜苷粗品→水稀释→大孔树脂吸附→洗脱2→乙醇回收2→减压干燥→罗汉果提取物。刘金磊,李典鹏,黄永林等.HPLC法测定不同生长期罗汉果苷ⅡＥ、Ⅲ、Ⅴ的含量[J].广西植物,2007,27(4):665-668，公开了用HPLC法测定同一产地不同生长期罗汉果中罗汉果苷ⅡE、Ⅲ、V的含量。采用外标法，检测条件为：色谱柱为ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×150mm，5µrn)；柱温为25℃；流动相为乙腈-水(体积比25:75)；流速为lmL/min；检测波长为203nm；进样量为20µL。在上述条件下罗汉果苷ⅡE、罗汉果苷Ⅲ和罗汉果苷V色谱峰与其它组分达到了良好分离。但是没有从55天果龄罗汉果中提取罗汉果苷IV、苷V及同步检测的方法报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种从55天果龄罗汉果中提取及检测罗汉果苷IV、苷V的方法，所得到的罗汉果提取物中，罗汉果苷IV含量大于5.0%，罗汉果苷V含量大于15.0%，检测时，罗汉果苷IV、罗汉果苷V的吸收峰明显，出峰时间分开，实现同步提取、检测罗汉果苷IV、罗汉果苷V。为了解决该技术问题，以质量比计，本专利技术采取的技术方案是：1、前处理取55天果龄的新鲜罗汉果为原料，称重、捣碎均匀；得罗汉果浆，备用。选取55天果龄的新鲜罗汉果为了确保原料中罗汉果苷IV、罗汉果苷V的含量都足以满足同步提取和检测，便于后面步骤。2、提取采用乙醇水溶液加超声波辅助提取。确保罗汉果苷IV、罗汉果苷V同步充分快速提取。以质量比例计，优选料液比1:2，将60%乙醇水溶液加入罗汉果浆中，控制温度为50℃，进行提取；用53Hz的超声波辅助提取30min；将料液用离心机在2500r/min离心15min，抽滤；滤渣再用60%乙醇水溶重复提取一次；合并滤液，得到罗汉果初提液。3、絮凝用Ca（OH）2乳浊液进行絮凝。除去罗汉果初提液中的杂质、果胶、蛋白质等，便于层析。优选加入罗汉果浆质量15%的10%Ca（OH）2乳浊液，进行搅拌絮凝；发现罗汉果提取液明显出现大分子物质聚沉的现象，待降至室温后，冷藏后取出，用离心机在2500r/min的速度离心15min，抽滤，得到澄清溶液。4、回收乙醇。便于层析时D101大孔树脂对罗汉果苷IV、罗汉果苷V的充分吸附。将到得澄清溶液浓缩至流浸膏状态，回收除去乙醇；加入纯水溶解流浸膏，得到提取澄清水溶液；5、层析。采用D101大孔树脂对罗汉果提取澄清水溶液进行吸附、分离、纯化。先上柱吸附，然后清洗、洗脱。过柱条件：上样液，将得到提取澄清水溶液调到pH为9.0，使用两倍柱体积每小时的流速过柱；过柱完成后依次用纯水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脱，流速都使用每小时两倍柱体积过柱，60%乙醇洗脱液总用量为3倍树脂床体积（BV），收集60%乙醇洗脱液。6、减压浓缩，干燥。将收集到的60%乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；将浓缩液进一步干燥，得到有高含量的罗汉果苷IV、罗汉果苷V的罗汉果提取物。在此基础上，用HPLC法对罗汉果提取物中罗汉果甜苷IV和甜苷V同时进行含量测定，检测步骤如下：1、标准品的制备用万分之一天平精确地称量8.2mg98.56%的罗汉果甜苷V标准品，置于10mL的容量瓶，用甲醇定容至刻度。在25℃下用超声波药品处理机超声15min，溶解。并用微孔滤膜过滤所得溶液，将过滤后的液体置于进样瓶待检测。再精确称量3.0mg98.79%的罗汉果甜苷IV标准品，处理方法和上述方法相同，最后置于进样瓶待检测，做好标记。2、供试品的制备精确称量30mg左右的罗汉果提取物样品，置于10ml的容量瓶，分别做好标记，并用甲醇定容至刻度，超声波处理15min后，用针筒吸取样品上清液，并经过微孔滤膜处理，将过滤后的样品液置于进样瓶待检测，做好标记。3、色谱柱条件C18柱（4.6mm×150mm），乙腈-水溶液的质量比例为21:79；检测波长设为203nm；流速1mL/min，柱温25℃，进样量10µL，跑柱30min。4、处理流动相将乙腈和纯水分别通过过滤装置，乙腈采用有机系滤膜，纯水采用水系滤膜；过滤是为了除去液体里的颗粒杂质，防止大颗粒物质进入高效液相色谱仪从而损坏仪器。将过滤后的液体分装到干净的流动相瓶子，并用保鲜膜封住瓶口，留一个小孔，再超声处理20min，超声处理流动相是为了除去液体里的气泡。所述的前处理、超声波水-乙醇提取、浓缩、柱层析、干燥、HPLC检测都为已知技术。本专利技术具有下列优点和特性：1、组合技术新颖。采用取55天果龄的新鲜罗汉果为原料，采用60%乙醇水溶液加超声波辅助提取，控制料液比1:2，温度为50℃，用53Hz的超声波辅助提取30min；离心，用罗汉果浆质量15%的10%Ca（OH）2乳浊液絮凝、离心、过滤、浓缩回收乙醇；采用D101大孔树脂对罗汉果提取澄清水溶液进行分离、纯化。pH为9.0，使用两倍柱体积每小时的流速过柱；过柱完成后依次用纯水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脱；收集60%乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥；得到有高含量的罗汉果苷IV、罗汉果苷V的罗汉果提取物。用HPLC法对提取物进行含量测定，色谱柱条件为C18柱（4.6mm×150mm），乙腈-水溶液的质量比例为21:79；检测波长设为203nm；流速1mL/min，柱温25℃，进样量10µL，跑柱30min。检测时，罗汉果苷IV、罗汉果苷V的吸收峰明显，出峰时间分开，所得到的罗汉果提取物中，罗汉果苷IV含量大于5.0%，罗汉果苷V含量大于15.0%，实现罗汉果苷IV、罗汉果苷V同步提取和检测。这些技术特征组合在一起，顺序不能颠倒、密不可分、互相支持，共同作用，才能得到所属的技术效果，组合技术方案不是已知技术，不是简单的叠加，具有突出的实质性特点和显著的进步。2、提取和检测方法组合在一起，实现罗汉果苷IV、罗汉果苷V同步高含量提取和检测，为研究罗汉果果龄与罗汉果苷IV、罗汉果苷V含量变化打下基础，具有实用性。附图说明图1：55天果龄罗汉果提取物HPLC图谱图2：罗汉果苷Ⅳ和苷V标准品混合进样HPLC图谱。具体实施方式以下结合实施例，进一步说明本专利技术。实施例1高含量罗汉果苷IV、罗汉果苷V提取物同步提取方法：1、取55天果龄的新鲜罗汉果2个，擦净并称重作好记录，捣碎机捣碎，得到罗汉果浆；以固液比1:2加入60%的乙醇水溶液，置于超声波仪器中。超声条件：超声波仪器频率53HZ、功率100W、温度50℃，超声30min后取出，冷却后纱布过滤，取滤液，将滤渣用相同法提取3次，合并3次滤液，待用。加入罗汉果浆重量的15%的10%Ca（OH）2悬浊液，并进行搅拌，此时会发现罗汉果提取液明显出现大分子物质聚沉本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从55天果龄罗汉果中提取及检测罗汉果苷IV、苷V的方法，其特征在于：包括提取步骤和检测步骤，所述提取步骤如下：1）前处理取55天果龄的新鲜罗汉果为原料，称重、捣碎均匀；得罗汉果浆，备用；2）提取采用60%乙醇水溶液加超声波辅助提取；以质量比例计，料液比1:2，控制温度为50℃，用53Hz的超声波辅助提取；将料液用离心机在2500r/min离心15min，抽滤；滤渣再用60%乙醇水溶重复提取一次；合并滤液，得到罗汉果初提液；3）絮凝用Ca（OH）2乳浊液进行絮凝，加入罗汉果浆质量15%的10%Ca（OH）2乳浊液，进行搅拌絮凝；离心，得到澄清溶液；4）回收乙醇将到得澄清溶液浓缩至流浸膏状态，回收除去乙醇；加入纯水溶解流浸膏，得到提取澄清水溶液；5）层析采用D101大孔树脂对罗汉果提取澄清水溶液进行分离、纯化；先上柱吸附，过柱条件：上样液，将得到提取澄清水溶液调到pH为9.0，使用两倍柱体积每小时的流速过柱；过柱完成后依次用纯水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脱，流速都使用每小时两倍柱体积过柱，60%乙醇洗脱液总用量为 3倍树脂床体积，收集60%乙醇洗脱液；6）减压浓缩，干燥将收集到的60%乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；将浓缩液进一步干燥，得到有高含量的罗汉果苷IV、罗汉果苷V的罗汉果提取物；所述检测步骤如下：用HPLC法检测A 标准品的制备用万分之一天平精确地称量8.2mg 98.56%的罗汉果甜苷V标准品，置于10mL的容量瓶，用甲醇定容至刻度，在25℃下用超声波药品处理机超声15min，溶解；并用微孔滤膜过滤所得溶液，将过滤后的液体置于进样瓶待检测；再精确称量3.0mg 98.79%的罗汉果甜苷IV标准品，处理，置于进样瓶待检测；B 供试品的制备精确称量30mg左右的样品，置于10ml的容量瓶，用甲醇定容，超声波处理15min后，用针筒吸取样品上清液，并经过微孔滤膜处理，将过滤后的样品液置于进样瓶待检测；C 色谱柱条件C18柱（4.6 mm×150mm），乙腈‑水溶液的质量比例为21:79；检测波长为203nm；流速1 mL/min，柱温25℃，进样量10µL，跑柱30min；D 处理流动相将乙腈和纯水分别通过过滤装置，乙腈采用有机系滤膜，纯水采用水系滤膜；将过滤后的液体分装到干净的流动相瓶子，并用保鲜膜封住瓶口，留一个小孔，再超声处理20min；E 样品检测。...
【技术特征摘要】
1.一种从55天果龄罗汉果中提取及检测罗汉果苷IV、苷V的方法，其特征在于：包括提取步骤和检测步骤，所述提取步骤如下：1）前处理取55天果龄的新鲜罗汉果为原料，称重、捣碎均匀；得罗汉果浆，备用；2）提取采用60%乙醇水溶液加超声波辅助提取；以质量比例计，料液比1:2，控制温度为50℃，用53Hz的超声波辅助提取；将料液用离心机在2500r/min离心15min，抽滤；滤渣再用60%乙醇水溶重复提取一次；合并滤液，得到罗汉果初提液；3）絮凝用Ca（OH）2乳浊液进行絮凝，加入罗汉果浆质量15%的10%Ca（OH）2乳浊液，进行搅拌絮凝；离心，得到澄清溶液；4）回收乙醇将到得澄清溶液浓缩至流浸膏状态，回收除去乙醇；加入纯水溶解流浸膏，得到提取澄清水溶液；5）层析采用D101大孔树脂对罗汉果提取澄清水溶液进行分离、纯化；先上柱吸附，过柱条件：上样液，将得到提取澄清水溶液调到pH为9.0，使用两倍柱体积每小时的流速过柱；过柱完成后依次用纯水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脱，流速都使用每小时两倍柱体积过柱，60%乙醇洗脱液总用量为3倍树脂床体积，收集60%乙醇洗脱液；6）减压浓缩，干燥将收集到的60%乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；将浓缩液进一步干燥，得到有高含量的罗汉果苷IV、罗汉果苷V的罗汉果提取...
【专利技术属性】
技术研发人员：周治德，王志宏，李桂银，黄勇，刘雯，杨裴庆，梁晋涛，王林林，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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