甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用制造技术

本申请公开了分子生物学领域的甲苯单加氧酶，所述甲苯单加氧酶的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术的积极进步效果在于：含所述甲苯单加氧酶的基因工程菌能有效催化硫醚底物不对称氧化，获得高光学纯度的（

Toluene monooxygenase and its application in the biocatalytic synthesis of chiral sulfoxide

In the field of molecular biology of toluene monooxygenase, amino acid sequence of the toluene monooxygenase is shown as SEQ ID No.1. The positive progress effect of the invention is that the genetically engineered bacteria containing toluene monooxygenase can effectively catalyze the asymmetric oxidation of sulfide substrates and obtain high optical purity.

【技术实现步骤摘要】
甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用。
技术介绍
手性亚砜是一类非常重要的生物活性物质，可作为手性中间体、辅剂、手性配体、催化剂以及临床药物，在有机合成和药物合成中有广泛的应用。目前，大多数化学催化剂在催化反应中还存在过度氧化、副产物多和反应条件苛刻等不足，且这些化学催化反应体系通常使用重金属催化剂和过氧酸等强氧化剂，不利于环境保护和可持续性发展的需求。生物酶的高效和高选择性，使得生物催化技术可望发展成为工业化绿色制备手性亚砜类药物的新途径。但现有研究表明，高活性，高对映选择性和高底物耐受性的手性亚砜合成酶还十分匮乏，无法满足绿色工业化生产的需求，获得高催化效率的生物酶和相应的生物催化合成方法，仍然是手性亚砜生物催化制备发展过程中的难点和瓶颈。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用。为了达到上述目的，本专利技术提供如下基础技术方案：甲苯单加氧酶（pmTOM），包含pmTOM-A和pmTOM-B两个亚基；其氨基酸残基序列如SEQIDNo.1所示。pmTOM是甲苯单加氧酶的英文解释。本专利技术所涉及的甲苯单加氧酶（pmTOM）是从实验室保存的菌种中分离获得，获得的方法为本领域常规方法；较佳地为从重组表达pmTOM的基因工程菌中分离获得或者人工合成获得。以下是对基础技术方案的优化：优化方案一，基于基础方案：所述甲苯单加氧酶为具有催化硫醚底物单加氧生成手性亚砜的蛋白质。优化方案二，基于基础方案或者优化方案一：所述的甲苯单加氧酶在手性亚砜制备中的应用。优化方案三，基于基础方案或者优化方案一：所述的甲苯单加氧酶的蛋白质编码基因。优化方案四，基于优化方案三：所述蛋白质编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术所述的甲苯单加氧酶（pmTOM）基因是从本实验室保存的菌种中克隆获得，获得的方法为本领域常规；较佳地为提取菌株基因组DNA，通过PCR扩增获得，或者根据SEQIDNo.2所示核苷酸序列人工合成获得。优化方案五，基于优化方案三：一种包含优化方案三所述甲苯单加氧酶的蛋白质编码基因的重组表达载体。优化方案六，基于优化方案四：一种包含优化方案四所述甲苯单加氧酶的蛋白质编码基因的重组表达载体。本专利技术所述重组表达载体由通过本领域常规方法将所述pmTOM的基因连接于各种骨架载体上构建而成；较佳地，可通过下述方法制得：将通过PCR所得的pmTOM-A和pmTOM-B基因扩增产物和骨架载体pETDute-1用限制性内切酶酶切，经连接酶连接后形成重组表达载体pETDute1-pmTOM。优化方案七，基于优化方案四：优化方案四的蛋白质编码基因在手性亚砜制备中的应用。优化方案七在实现时，包括以下步骤：将培养的基因工程菌，悬浮于缓冲液，加入硫醚底物，放入摇床反应后，萃取并收集有机相，用无水硫酸钠干燥，离心除去硫酸钠并过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得（R）构型的手性亚砜。优化方案八，基于优化方案五：一种包含优化方案五所述重组载体的基因工程菌。优化方案九，基于优化方案六：一种包含优化方案六所述重组载体的基因工程菌。本专利技术所述基因工程菌由通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得；所述宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的甲苯单加氧酶基因可被有效表达即可；较佳地，将所述重组表达质粒pETDute1-pmTOM转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。本专利技术所述的基因工程菌既可以是含所述甲苯单加氧酶的休止细胞，生长中的细胞，也可以是固定化的细胞，或者纯化后的甲苯单加氧酶蛋白。较佳的为含所述甲苯单加氧酶的休止细胞。本专利技术的积极进步效果在于：含所述甲苯单加氧酶的基因工程菌能有效催化硫醚底物不对称氧化，获得高光学纯度的（R）构型亚砜。相对于其它现有的制备方法，使用所述制备方法反应时间短，反应条件温和，对环境友好，操作简便。含甲苯单加氧酶重组蛋白的基因工程菌催化硫醚底物的反应过程为：本专利技术所述的甲苯单加氧酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述基因工程菌，加入IPTG诱导剂后，从细胞中获得甲苯单加氧酶；所述培养的方法和条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要使基因工程菌能够生长并产生所述亚砜还原酶即可；较佳地，为下述方法：挑取单菌落于2mLLB培养基，于37℃摇床180rpm的转速下培养12h后，转入含有50mLLB培养基的250mL的大摇瓶，培养至OD600=0.6时加入终浓度为0.2μM的IPTG，20℃下继续培养14h后，于5000rpm的条件下离心去除上清液，获得含所述亚砜还原酶的菌株细胞；所述培养所用的培养基为本领域任何可使所述基因工程菌生长并产生所述亚砜还原酶的培养基；较佳地为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl5g/L，pH7.0。附图说明图1为本专利技术甲苯单加氧酶重组表达质粒pETDute1-pmTOM的示意图；图2为pmTOM重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图片；泳道1为蛋白质分子量标志；泳道2为pmTOM重组蛋白的表达情况，箭头所示分别为pmTOM-A和pmTOM-B蛋白条带。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1：甲苯单加氧酶基因的获得，包括以下步骤：以基因组DNA为模板，使用引物F：5’-CCGGGGATCCGATGAGAAGTTTCTTTCAATC-3’和R：5’-AATTGTCGACTTAGGAGTTCCGGCCGTCCG-3进行PCR扩增获得pmTOM-A基因；使用引物F：5’-CCGGAGATCTCATGTGGGAATACATCAAGTAC-3’和R：5’-TTAACTCGAGGCCGCGAGCCAAGGAAGGAC-3’进行PCR扩增获得pmTOM-B基因。PCR反应体系如下：2×TaqPCRMasterMix10.0μL、基因组DNA1μL、上下游引物各0.5μL、ddH2O8.0μL。PCR反应条件：95℃10min；98℃10s，56℃30s，72℃90s，30个循环循环；72℃延伸10min。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳验证是否获得符合目的基因大小的片段。实施例2：甲苯单加氧酶基因表达载体构建，包括以下步骤：用限制性内切酶BamHI和SalI对含有pmTOM-A基因序列的DNA片段及载体pETDute-1进行双酶切，酶切回收的目的片段和载体。用T4DNA连接酶，16℃连接4h后，连接产物转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后，挑取长出的单克隆菌落摇菌并提取质粒，利用BamHI和SalI对重组质粒pETDute1-pmTOMA进行双酶切检测。接着，接着用BglII和XhoI对pmTOM-B基因及pETDute1-pmTOMA进行同样的操作后，获得重组载体pETDute1-pmTOM，并进行DNA测序以确保序列准确。最后将测序准确的阳性重组质粒转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，甘油（终浓度为20%）本文档来自技高网...

【技术保护点】
甲苯单加氧酶，其特征在于：所述甲苯单加氧酶的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.甲苯单加氧酶，其特征在于：所述甲苯单加氧酶的氨基酸残基序列如SEQIDNo.1所示。2.如权利要求1所述的甲苯单加氧酶，其特征在于：所述甲苯单加氧酶为具有催化硫醚底物单加氧生成手性亚砜的蛋白质。3.如权利要求1或2所述的甲苯单加氧酶的应用，其特征在于，所述甲苯单加氧酶在手性亚砜制备中的应用。4.一种包含如权利要求1或2所述的甲苯单加氧酶的蛋白质编码基因。5.如权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：程小玲，杨加伟，陈永正，周阳，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52