长效重组猪FSH融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了两种长效重组猪FSH融合蛋白，包括pFSH‑Fc‑1和pFSH‑Fc‑2，其α亚基/β亚基直接或间接通过连接元件融合至Fc片段上，β亚基/α亚基通过范德华力或连接元件与α亚基/β亚基结合。所述猪FSH融合蛋白可基于基因工程技术，利用真核表达系统制备得到。两种猪FSH融合蛋白药效好，比天然猪FSH半衰期长；又不会对动物产生不良效应，可替代孕马血清促性腺激素(PMSG)在动物繁殖生产中的使用。本发明专利技术还涉及两种猪FSH融合蛋白在制备动物繁殖领域药物中的用途。

Long effect recombinant pig FSH fusion protein and its preparation and Application

The present invention discloses two long-acting recombinant porcine FSH fusion protein, including pFSH Fc 1 and pFSH Fc 2, its subunit alpha / beta subunit directly or indirectly through the connecting element fusion to the Fc fragment, subunit beta / alpha subunit by van Edward or the connecting element and the alpha subunit / beta subunit binding. The porcine FSH fusion protein can be obtained from the eukaryotic expression system based on the gene engineering technology. The two swine FSH fusion protein has good efficacy and longer half-life than natural pig FSH. It has no adverse effects on animals and can replace the use of pregnant horse serum gonadotropin (PMSG) in animal reproduction. The invention also relates to the use of two kinds of pig FSH fusion protein in the preparation of drugs in the field of animal breeding.

【技术实现步骤摘要】
长效重组猪FSH融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医药和动物繁殖
，具体地说，涉及一种长效重组猪FSH融合蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
猪促卵泡素(PorcineFollicle-stimulatinghormone，简称pFSH)是一种猪垂体前叶分泌的促性腺激素，由一个α亚基和一个β亚基非共价连接，其中α亚基高度保守，与猪促黄体素(PorcineLuteinizingHormone,pLH)、猪绒毛膜促性腺激素(PorcineChorionicGonadotro–phin,pCG)、猪促甲状腺素(PorcineThyroidStimulatingHormone,pTSH)的α亚基完全相同；β亚基存在差异，主要决定FSH的功能特异性。pFSH可以促进母猪子宫内膜、卵巢和卵泡的生长和成熟；促进雌激素的合成与分泌；诱导公猪曲细精管的发育和维持精子生成。pFSH在动物繁殖领域中常用于同期发情、超数排卵、胚胎移植、母畜卵巢疾病的治疗。有研究表明猪FSH用于牛、羊的超排效果要好于牛羊自身的FSH，因此pFSH对畜牧生产和经济动物繁殖具有重要价值。目前已有相关专利和文章报道了FSH融合蛋白的表达，但大部分是关于人FSH的重组表达与应用，将人FSH用于动物繁殖领域，也获得了一些成功。然而尽管人与家畜同属于哺乳动物，但在蛋白序列上仍存在较大的种属差异(人和猪FSHα亚基氨基酸序列同源性为73％，β亚基同源性为93％，Fc片段同源性为73％)。如果长期将人重组FSH用于动物上，会被动物的免疫系统识别诱生抗体(包括中和抗体)，这些抗体特异性结合动物FSH的受体结合位点，从而阻断药物的生物学活性，导致人FSH在动物体内的生物利用度越来越低，限制了人FSH在动物，尤其是需要长期使用FSH的猪、牛、羊等经济动物上的应用，这也是目前市售的人重组FSH不用于动物繁殖领域的原因之一。目前市面上畜用FSH产品主要包括猪垂体提取的FSH和孕马血清促性腺激素(PMSG)。猪垂体FSH，如Folltropin-V(加拿大)，半衰期短(5h)，需要频繁给药，导致终端客户给养和管理成本高；并且从猪垂体组织中提纯时很难将猪FSH与LH分离、纯化难度大、产能低，所以在实际应用中受到很大限制。PMSG是一种马属动物胎盘尿囊绒毛膜细胞分泌的糖蛋白激素，兼具FSH(高)和LH(低)活性，具有促进动物卵巢和睾丸生殖机能的作用。在动物繁殖领域，常用于诱发雌性动物同期发情、超数排卵，治疗雌性动物繁殖障碍和卵巢功能不全；促进雄性动物曲细精管发育和精子生成。但因PMSG分子含有较高的己糖和唾液酸，在动物体内半衰期太长(120h)，用于动物超数排卵时，容易引发母畜的多种不良效应，如卵巢囊肿，妊娠初期胚胎的提前退化；并且商品化的PMSG从孕马血清中提取纯化，用于其它动物时会产生抗体，存在一定的免疫原性，不能长时间使用。此外，从怀孕母马采集血清制备PMSG，经常因采血过多导致母马流产、胎马死亡，不符合动物伦理。因此基于人FSH不适用于动物、猪垂体FSH需要频繁给药、PMSG易产生不良效应，动物繁殖领域特别是经济动物需要长效的动物源FSH。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的长效重组猪FSH融合蛋白及其制备方法与应用。本专利技术的构思如下：Fc融合蛋白技术是蛋白药物长效化研发中最广泛使用且最稳定的技术之一，利用基因工程技术将FSH与Fc融合产生新型重组蛋白FSH-Fc。不仅能保留FSH的高生物活性，还可以获得较长的半衰期；同时得到的重组蛋白纯度高，质量相对均一，不含有LH，安全系数高。使用哺乳动物表达体系，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达重组蛋白，能获得在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然的蛋白分子。为了实现本专利技术目的，本专利技术的长效重组猪FSH融合蛋白，包括融合蛋白pFSH-Fc-1和pFSH-Fc-2，其中所述猪FSH融合蛋白pFSH-Fc-1的α亚基直接或间接通过连接元件融合至Fc片段上，β亚基通过范德华力或连接元件与α亚基结合；所述猪FSH融合蛋白pFSH-Fc-2的β亚基直接或间接通过连接元件融合至Fc片段上，α亚基通过范德华力或连接元件与β亚基结合。所述猪FSH融合蛋白包括两条肽链，符合以下方程：(pFSHβ:pFSHα-L-Fc)2或(pFSHα:pFSHβ-L-Fc)2，其中pFSHβ是指猪FSH去除信号肽的β亚基；冒号代表猪FSHβ亚基和α亚基以范德华力连接的关系；pFSHα是指猪FSH去除信号肽的α亚基；L代表pFSHα或pFSHβ亚基与Fc片段的连接关系；Fc是指免疫球蛋白的Fc片段或其突变体；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。所述pFSHα的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或者与SEQIDNO:1同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。所述pFSHβ的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，或者与SEQIDNO:3同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。所述Fc包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3区。所述免疫球蛋白来自人、猪、牛、羊、马或狗。免疫球蛋白分为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，每种免疫球蛋白包括各种亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。所述Fc突变体是指Fc片段上含有一个或几个突变氨基酸位点的Fc变体，例如人IgG2Fc变体，其含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区。优选地，所述Fc来自猪的免疫球蛋白，即pFc，包含猪免疫球蛋白的铰链区、CH2和CH3区。所述pFc的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，或者与SEQIDNO:5同源性在80％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。所述pFSHα或pFSHβ亚基与Fc的连接关系为直接拼接连接或通过linker连接，优选通过linker连接。其中，所述linker是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基酸选自Gly、Ser、Ala和Thr中的至少一种。优选地，所述linker为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为2-5之间的整数，更优选n为3。优选地，所述pFSHα-L-Fc为：i)由SEQIDNo.6所示的氨基酸序列构成的蛋白；或ii)SEQIDNo.6所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由i)衍生的蛋白；或iii)与SEQIDNo.6所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。优选地，所述pFSHβ-L-Fc为：iv)由SEQIDNo.8所示的氨基酸序列构成的蛋白；或v)SEQIDNo.8所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由iv)衍生的蛋白；或vi)与SEQIDNo.8所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。本专利技术还提供表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系，其包括包含编码上述融合蛋白的核酸。本专利技术的长效重组猪FSH融合蛋白可按如下方法制备得到：人工合成pFSHα、pFSHβ、pFSHα-L-Fc和pFSHβ-L-Fc的编码基因，并进行密码子优化，优化后的基因分别克隆到真核表达载本文档来自技高网...

【技术保护点】
长效重组猪FSH融合蛋白，其特征在于，包括融合蛋白pFSH‑Fc‑1和pFSH‑Fc‑2；所述猪FSH融合蛋白pFSH‑Fc‑1的α亚基直接或间接通过连接元件融合至Fc片段上，β亚基通过范德华力或连接元件与α亚基结合；所述猪FSH融合蛋白pFSH‑Fc‑2的β亚基直接或间接通过连接元件融合至Fc片段上，α亚基通过范德华力或连接元件与β亚基结合。

【技术特征摘要】
1.长效重组猪FSH融合蛋白，其特征在于，包括融合蛋白pFSH-Fc-1和pFSH-Fc-2；所述猪FSH融合蛋白pFSH-Fc-1的α亚基直接或间接通过连接元件融合至Fc片段上，β亚基通过范德华力或连接元件与α亚基结合；所述猪FSH融合蛋白pFSH-Fc-2的β亚基直接或间接通过连接元件融合至Fc片段上，α亚基通过范德华力或连接元件与β亚基结合。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述猪FSH融合蛋白包括两条肽链，符合以下方程：(pFSHβ:pFSHα-L-Fc)2或(pFSHα:pFSHβ-L-Fc)2，其中pFSHβ是指猪FSH去除信号肽的β亚基；冒号代表猪FSHβ亚基和α亚基以范德华力连接的关系；pFSHα是指猪FSH去除信号肽的α亚基；L代表pFSHα或pFSHβ亚基与Fc片段的连接关系；Fc是指免疫球蛋白的Fc片段或其突变体；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述pFSHα的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或者与SEQIDNO:1同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白；所述pFSHβ的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，或者与SEQIDNO:3同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3区；所述免疫球蛋白来自人、猪、牛、羊、马或狗；所述Fc突变体是指Fc片段上含有一个或几个突变氨基酸位点的Fc变体，包括人IgG2Fc变体，其含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc来自猪的免疫球蛋白，即pFc，所述pFc的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，或者与SEQIDNO:5同源性在80％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。6.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述pFSHα或pFSHβ亚基与Fc的...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，师磊，韩国，
申请(专利权)人：北京伟杰信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11