融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及包含通过使用肽接头融合至人IgG Fc区的胰岛素受体激动剂的融合蛋白，以及此类融合蛋白在糖尿病治疗中的用途。本发明专利技术的融合蛋白具有延长的时间作用概况并且可用于提供延长时段的基础血糖控制。

fusion protein

The present invention relates to fusion joints by using peptide containing IgG Fc region of the insulin receptor agonist of the fusion protein, and the application of this kind of fusion protein in the treatment of diabetes. The fusion protein of the present invention has an extended time - acting overview and can be used to provide basic blood glucose control for extended periods.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】融合蛋白本专利技术涉及用于治疗糖尿病的融合蛋白。更具体而言，本专利技术涉及包含用肽接头融合至人IgGFc区的胰岛素受体激动剂的融合蛋白，以及此类蛋白在糖尿病治疗中的用途。本专利技术的融合蛋白具有延长的时间作用概况并且可用于提供延长的基础葡萄糖控制和肝葡萄糖排出的抑制。糖尿病是一种慢性病症，其特征在于由于胰岛素分泌、胰岛素作用或者两者的缺陷而导致的高血糖。1型糖尿病特征在于几乎没有胰岛素分泌能力或者没有胰岛素分泌能力，并且患有1型糖尿病的患者需要胰岛素来生存。2型糖尿病特征在于由于受损的胰岛素分泌、胰岛素抗性、过多的肝葡萄糖排出和/或来自上述所有的贡献而导致的升高的血糖水平。在患有2型糖尿病的患者的至少三分之一中，疾病进展至绝对需要胰岛素疗法。为了实现正常的血糖，需要使胰岛素替代疗法尽可能接近地类似于正常个体中的内源性胰岛素分泌的模式。胰岛素的每日生理需要量存在波动并且可分成两个阶段；(a)进餐时阶段，其需要脉冲量(大剂量)的胰岛素来处理与进餐相关的血糖激增(surge)；和(b)进餐间阶段，其需要维持(基础)量的胰岛素来调节肝葡萄糖排出，用于维持最佳的空腹血糖。因为1型糖尿病患者几乎不产生胰岛素或者不产生胰岛素，所以用于1型糖尿病的有效胰岛素疗法一般涉及使用两种类型的外源施用的胰岛素：通过大剂量注射提供的速效进餐时胰岛素，和每日施用一或两次以控制进餐之间的血糖水平的长效基础胰岛素。患有2型糖尿病的患者的治疗通常以规定的体重减轻、锻炼和糖尿病饮食开始，但是当这些措施未能控制升高的血糖时，则口服用药和基于肠降血糖素的疗法，诸如施用实现升高的肠降血糖素水平的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂和/或二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂，可能是必要的。当这些用药仍然不足时，考虑用胰岛素进行治疗。疾病已经进展到需要胰岛素疗法的点的2型糖尿病患者一般以每日单次注射长效的基础胰岛素开始治疗，尽管在一些情况下，可根据需要包括速效胰岛素的进餐时间注射。几种类型的基础胰岛素是当前可用的。以商品名LANTUS®销售的甘精胰岛素包含修饰的胰岛素结构，其中胰岛素A链中位置21处的天冬酰胺由甘氨酸取代，并且两个精氨酸被添加至B链的C末端。以商品名LEVEMIR®销售的地特胰岛素包含修饰的胰岛素结构，其中B链中的位置30处的苏氨酸已经缺失并且B链中的位置29处的赖氨酸已经通过14-碳、肉豆蔻酰脂肪酸与B29处的赖氨酸的ε-胺基的共价键而衍生化。可在欧洲和日本以商品名TRESIBA®得到的德谷胰岛素(Insulindegludec)包含修饰的胰岛素结构，其中B链中的位置30处的苏氨酸已经缺失，并且B链中的位置29处的赖氨酸的ε-氨基经由γ-L-谷氨酸接头与十六烷二酸共价地衍生化。所有这些胰岛素都被指示为每日施用一次。涉及每日注射现有胰岛素疗法的治疗方案可以是施用复杂和痛苦的并且可导致不期望的副作用，诸如低血糖和体重增加。因此，许多糖尿病患者不愿意或不能够遵从，或者不会遵从维持血糖水平的密切控制所必需的胰岛素疗法。不良的血糖控制增加了患者发展出严重的糖尿病相关并发症(包括心脏病、中风、神经损伤、下肢截肢、视力丧失和肾病)的风险。正在进行研究以鉴定具有较长作用持续时间；因此需要比当前可用的胰岛素产品更少的注射以改善可接受性和遵从性的胰岛素产品。CN103509118描述了蛋白，其具有通过4至50个氨基酸C-肽连接序列接合的人胰岛素B链和人胰岛素A链，且胰岛素A链直接附接(无额外的接头)至免疫球蛋白Fc片段，并且记载小鼠中的测试表明此类蛋白具有长达约3天的体内半衰期。KR101324828描述了通过使用非肽基接头连接至免疫球蛋白Fc区的胰岛素原类似物，并且记载此类蛋白提供相比于现有疗法延长的血清半衰期。该公开记载非肽基接头表示对肽接头的改善，认为使用肽接头的融合蛋白无法延长活性药物在血液中的半衰期，因为肽接头容易被体内的酶切断。尽管存在上述和/或任何其他出版物中的公开内容，本专利技术人克服了多个障碍来发现包含胰岛素受体激动剂、肽接头和人IgGFc区的融合蛋白，其满足对具有延长的作用持续时间的降血糖产品的不断需要，足以比当前可用的胰岛素产品频率更低地给药，包括不频繁至一周一次地给药。例如，为了实现所期望的延长的时间作用概况，有必要工程改造具有衰减功效以避免快速的受体介导的清除(胰岛素清除的主要途径)、但仍然具有足够的功效来提供充分降血糖的融合蛋白。此外，为了使肾清除(胰岛素清除的另一种主要途径)最小化并且为了通过流体动力学尺寸限制的细胞旁路扩散调节外周暴露，必须将融合蛋白工程改造为足够大并且胰岛素受体激动剂不会在施用后被从人IgGFc区蛋白水解切割，因为即使人IgGFc区在循环中保留，此类切割会导致对胰岛素受体激动剂比所需更快的肾清除。此外，IgGFc结构域已经进化成自缔合以形成稳定的二聚体，并且当此类二聚体由两种融合蛋白(其各自包含与IgGFc区融合的胰岛素部分)形成时，使两种胰岛素部分彼此紧邻，使得通过胰岛素B链自缔合区介导的胰岛素部分能够自缔合或二聚化。此类胰岛素二聚体是无活性的，因此必须工程改造胰岛素受体激动剂部分自缔合减少的融合蛋白。克服了许多额外的挑战来产生适合于商业制造和配制作为治疗剂的融合蛋白。本专利技术提供融合蛋白，其相比于现有胰岛素疗法具有延长的作用持续时间，允许比现有胰岛素产品更不频繁地注射(包括长达每周一次)，因此减少与涉及更频繁的注射的现有治疗方案相关的复杂性和疼痛。本专利技术的融合蛋白具有平坦的药代动力学概况和有限的外周暴露，导致低逐日变化性和最小的低血糖症发病率，包括当与额外的糖尿病药疗法(诸如基于肠降血糖素的疗法)组合提供时。本专利技术的融合蛋白也可提供延长的作用持续时间，而不引起体重增加。本专利技术提供融合蛋白，其包含：a)胰岛素受体激动剂，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中i)Z1是胰岛素B链类似物，包含以下氨基酸序列：其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在，条件是该胰岛素B链类似物包括在X4、X5、X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰(SEQIDNO:1)；ii)Z2是第一肽接头，其包含5至10个氨基酸，其中所述氨基酸中的至少5个是G残基；且iii)Z3是胰岛素A链类似物，其包含以下氨基酸序列：X1是T或I；X2是D、Y、Q或E；X3是G、N、S或A；并且X4是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是如果X3是N，则X4必须是除G或N以外的氨基酸(SEQIDNO:2)；b)第二肽接头；以及c)人IgGFc区；其中胰岛素受体激动剂的C末端残基直接融合至第二肽接头的N末端残基，并且第二肽接头的C末端残基直接融合至IgGFc区的N末端残基。本专利技术还提供融合蛋白，其由以下组成：a)胰岛素受体激动剂，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中i)Z1是胰岛素B链类似物，其具有以下氨基酸序列：其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合蛋白，其包含：a)胰岛素受体激动剂，其具有通式Z1‑Z2‑Z3，其中：i) Z1是胰岛素B链类似物，其包含以下氨基酸序列：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.07 US 62/1580791.融合蛋白，其包含：a)胰岛素受体激动剂，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中：i)Z1是胰岛素B链类似物，其包含以下氨基酸序列：其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在，条件是所述胰岛素B链类似物包括在X4、X5、X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰(SEQIDNO:1)；ii)Z2是包含5至10个氨基酸的第一肽接头，其中所述氨基酸中的至少5个是G残基；且iii)Z3是胰岛素A链类似物，其包含以下氨基酸序列：其中X1是T或I；X2是D、Y、Q或E；X3是G、N、S或A；并且X4是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是如果X3是N，则X4必须是除G或N以外的氨基酸(SEQIDNO:2)；b)第二肽接头；和c)人IgGFc区；其中所述胰岛素受体激动剂的C末端残基直接融合至所述第二肽接头的N末端残基，并且所述第二肽接头的C末端残基直接融合至所述人IgGFc区的N末端残基。2.权利要求1的融合蛋白，其中：所述胰岛素B链类似物包括在SEQIDNO:1的X4或X5处对所述人胰岛素B链的氨基酸序列的至少一种修饰；且所述胰岛素A链类似物包括在SEQIDNO:2的X1或X2处对所述人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。3.权利要求1或2中任一项的融合蛋白，其中：所述胰岛素B链类似物包含SEQIDNO:1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H；且所述胰岛素A链类似物包含SEQIDNO:2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。4.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述胰岛素B链类似物包含SEQIDNO:1的序列，其中X6-X9各自是G。5.权利要求1-4中任一项的融合蛋白，其中所述第一肽接头包含以下氨基酸序列：其中X1是G或不存在；且X2是G、S或不存在(SEQIDNO:3)。6.权利要求5的融合蛋白，其中SEQIDNO:3的X1和X2分别是G和S。7.权利要求1-6中任一项的融合蛋白，其中所述胰岛素受体激动剂具有以下氨基酸序列：。8.权利要求1-7中任一项的融合蛋白，其中所述第二肽接头是具有10至25个氨基酸的肽，其中所述氨基酸中的至少50%是G残基。9.权利要求1-8中任一项的融合蛋白，其中所述第二肽接头包含具有序列[GGGGX]n的肽，其中X是Q、E或S；且其中n是2-5。10.权利要求1-9中任一项的融合蛋白，其中所述第二肽接头包含以下氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：DB鲍德温，JM比尔斯，JW戴，CD迪金森，AI科里特科，GA拉扎，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：美国,US